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心筋細胞のミトコンドリアを標的としたリポソームによる薬剤送達治療に関する研究

辻岡, 孝郎 北海道大学

2022.03.24

概要

【背景と目的】ドラッグ・デリバリー・システムの1つであるリポソームは、心血管疾患の診断・治療技術にも応用されており、臨床応用を目指して様々な前臨床試験が行われている。北海道大学大学院薬学研究院薬剤分子設計学研究室のYamadaらは、独自のリポソームを開発して細胞ミトコンドリアを標的とした治療について研究している。著者は、その1つであるMultifunctional envelope-type nano device for pancreaticβcells（β-MEND）を利用し、抗酸化作用や心保護効果が報告されている天然ポリフェノール類のレスベラトロール（Resveratrol：RES）を封入して心筋ミトコンドリアへ送達することでミトコンドリア呼吸能を賦活できるかどうかについて検証した。

【材料と方法】β-MENDは単純水和法で調製し、Egg yolk phosphatidylcholine（EPC）、3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol（DC-Chol）、Sphingomyelin（SM）という3種類の脂質を4：3：3のモル比率でガラス管内に混合し、さらにRESも添加し、溶媒を除去して形成される脂質膜を、2-[4-(hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethane sulfonic acid（HEPES）の緩衝液で水和することで得られた。心筋細胞モデルには、ラット心筋芽細胞であるH9c2細胞を使用した。β-MENDの細胞内取込みについては、蛍光染色したβ-MENDをH9c2細胞と共培養した後に回収して、Fluorescence-activated cell sorter（FACS）で検証し、蛍光強度と細胞数の積分値であるMean　fluorescent intensity（MFI）として計測した。細胞内に取込まれたβ-MENDの細胞内局在を確認するためにミトコンドリアへの染色も追加して、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Confocal laser scanning microscope： CLSM）で観察した。β-MENDの細胞毒性についてはPremix WST-1 Cell Proliferation Assay Systemを用いて検証することとし、様々な濃度のβ-MENDと共培養後の細胞に同試薬を添加し、その後440nmと650nmの吸光度の差を細胞生存能として計測した。β-MEND投与による細胞ミトコンドリア呼吸能の変化については、細胞をβ-MENDと共培養した後に、Seahorse XF HS Mini Analyzerで酸素消費量（Oxygen consumption rate：OCR）を計測した。

【結果】以下、数値をすべて平均±標準偏差で表す。RESを封入したβ-MEND（β-MEND（RES））を単純水和法で調製したところ、粒子径79.7±10.2nm、ゼータ電位37.7±8.6mVと、100nm未満の安定した粒子径で表面が正に帯電していた。FACSで計測したMFIは、未処理群が36,426.55±1,626.27だったのに対し、β-MEND（RES）投与群では2,273,007.42±730,514.48と有意に上昇していた（p<0.01）。CLSMでの観察では、細胞内に取込まれたβ-MEND（RES）の一部がミトコンドリアと共局在していることを確認できた。β-MEND（RES）の細胞毒性については、未処理群やリポソームに封入しなかったRESのみ（naked RES）を投与した群と比較して、RES相当で5、10、20、30μMの濃度では、試薬添加後の吸光度は有意に低下せず、β-MEND（RES）によって細胞生存能は有意に低下しないと解釈できた。以上までのβ-MENDの物性、細胞内取込み、ミトコンドリアとの共局在、細胞毒性については、β-MEND（RES）だけでなく、RESを封入していないβ-MEND（Emptyβ-MEND）でも同等の結果が得られ、両者の間で有意差は見られなかった。ミトコンドリア呼吸能の指標であるOCRについては、未処理群やnaked RES群と比較してβ-MEND（RES）群では、基礎呼吸能（Basal respiration）は114.1±21.0%ofControlと有意な上昇を認めなかったが、最大呼吸能を表すMaximal respirationやSpare respiratory capacityはそれぞれ233.6±43.9%ofControl、390.6±83.8%ofControlと有意に上昇した（p<0.01）。

【考察】β-MENDは、心筋細胞内に効率的に取り込まれた後にミトコンドリアまで到達し、封入していたRESがミトコンドリア呼吸能を賦活化した。また、細胞毒性を認めなかった。その分子学的な作用機序としては、サーチュイン3の活性化によるATP合成酵素やカルジオリピンの機能向上などが知られている。Seahorse XF Analyzerシリーズでの検討で、基礎呼吸能は変化せず最大呼吸能だけが上昇したという現象についてもいくつか報告があるが、その機序ははっきりしていない。最大呼吸能の上昇は、その細胞がストレスに晒された際に産生できるエネルギーの予備能を示していると報告されており、ミトコンドリア呼吸能を予め強化しておくことで、様々な病態による細胞傷害を軽減しうる可能性が考えられた。

【結語】本論文は、心筋細胞のミトコンドリアを標的とした独自のリポソームを利用して、内部に封入したRESをミトコンドリアまで送達することでその呼吸能が賦活されることをSeahorse XF Analyzerシリーズで検証した、初めての報告である。臨床応用に向けて、検討しなければならない課題は多々あるが、本薬剤は、心筋を治療しうる新規のリポソーム製剤の候補となり得る。

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参考文献

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