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Tendon-Specific Dicer Deficient Mice Exhibit Hypoplastic Tendon Through the Downregulation of Tendon-Related Genes and MicroRNAs

大本 武児 広島大学

2022.08.29

概要

腱は力を伝達する関節運動に重要な線維性結合組織であり、分子生物学的に未知な点が多い。臨床では修復腱の石灰化や瘢痕形成が問題になるが、治療法の進歩は乏しい。遺伝子改変マウスよりScleraxis(Sex)やMohawk(Mkx)といった健の発達・成熟に重要な転写因子や、Tenomodulin(Tnmd)などの腱特異的な細胞外マトリックス(ECM)が明らかになってきたが、腱の分化や修復の詳細な分子機構は未だ不明である。microRNA(miRNA)は、標的遺伝子を負に制御し、発生や細胞・組織恒常性の維持のほか、その発現異常により様々な疾患に関与している。miRNAの生成に関与するRNAプロセッシング酵素のDICERは、その欠損によるmiRNA生成・機能不全から胎生致死となり、軟骨特異的Dicer欠損マウスでは軟骨発生に関与しているとされる。しかし、腱でのDICER-miRNAsの役割や腱特異的なmiRNAは不明である。
 本研究は、腱でのDicer-miRNAの役割を明らかにし、腱特異的miRNAの同定を目的とした。

 腱特異的転写因子Sexの発現制御領域下にCreリコンビナーゼをノックイン(KI)したto:CreKIマウスとDicer floxedマウスを交配し、腱特異的Dicer欠損(Dicer cKO)マウスを作製・角军析した。
1. 腱特異的Dicer cKOマウスの腱の表現型
①腱の脆弱性
 体長や体重に差は無いが、アキレス腱、膝蓋腱、前腕筋腱での肉眼的脆弱性を認めた。アキレス腱組織の横断面積はDicer cKOで小さく、単位面積の細胞数に差はなかった。さらに、透過型電子顕微鏡でコラーゲン線維径を計測すると、Dicer cKOでは小径のコラーゲンが多数存在し、線維径の分布が乱れていた。
②腱の機能低下
 Dicer cKOでは、筋力測定やアキレス腱の破断強度に差はなかったが、腱の引っ張りによる伸長が大きくなり、歩行動作解析で足関節の可動域が拡大した。
③治癒能力の低下
 アキレス腱損傷モデルを作成し、腱修復の組織学的な違いを腱修復スコアリングシステムで比較した。Dicer cKOでは、修復腱に異所性骨化へと至る軟骨化生像が散見され、治癒能力の低下を認めた。
④腱線維芽細胞の増殖細胞数の低下
 DICERは細胞死や増殖、分化に関与するとされるが、生後3日のDicer cKOのアキレス腱ではEdU陽性である増殖腱線維芽細胞数が低下した。一方で、TUNEL陽性腱線維芽細胞は検出されず、免疫染色では細胞外基質のType I CollagenやTENOMODULINの差異は検出されなかった。

2. Dicer cKOのアキレス腱での腱関連遺伝子及びmiRNAの発現
 Dicer cKOによるmiRNAの発現低下や遺伝子発現の変化が腱の低形成に関与すると考え、RNAシーケンスによる網羅的遺伝子およびmiRNA発現解析、リアルタイムPCRを行った。Dicer cKOで腱関連転写因子であるScx、Mkx、Egrlの発現が低下し、それらに制御される主要な腱関連基質のCollal、Col3al、Tnmd等の発現低下を認めた。また、腱幹/前駆細胞マーカー遺伝子のPdgfraやTppp3の発現も低下した。実際に遺伝子オントロジー(GO)解析で、Dicer cKOで発現が減少した遺伝子群は、骨格系の発生やECMの組織化といった生物学的プロセスに関与していた。さらに、腱で高発現し、Dicer cKOによって発現が減少するmiRNAがDicer cKOの表現型に深く関与する腱特異的なmiRNAと考え、Dicer cKOで発現差が著しい上位10のmiRNAに着目した。中でもmiR-135aとmiR-1247は腱特異的な発現パターンであり、Dicer cKOで発現が低下していた。さらに、損傷腱由来腱線維芽細胞へのmiR-135amimicの過剰導入は、転写因子SexやTnmdなどの健基質遺伝子や健幹/前駆細胞マーカ一遺伝子Tppp3の発現を誘導した。そして、Dicer cKOで発現が増加したmiR-135aの標的候補を含む遺伝子群は、GO分析で細胞周期に最も関連していた。miR-135aは、腱幹/前駆細胞の増殖・分化に関与し、Dicer cKOで観察された腱の低形成に関連しているかもしれない。
 本研究は、腱特異的Dicer KOマウスが腱関連遺伝子やmiRNAの発現減少を介した腱の脆弱性や機能低下、治癒能力の低下を示したことから、DICER-miRNAは腱の成熟に関与しており、miR-135aの重要性を示唆した。今後、miR-135aの標的遺伝子の同定や腱発生・成熟への関与を遺伝子改変マウスで明らかにし、それを利用した新たな腱再生・修復治療法の開発が期待される。

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参考文献

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