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培地中の細胞外ミトコンドリアDNAを用いた胚盤胞期胚の非侵襲的評価

小林 充 東京農業大学

2021.09.24

概要

ヒト生殖補助医療は,世界的に一般的かつ周知の医療となりつつある。

卵巣刺激法による過排卵処理の普及や培養技術の向上により,患者は一度の採卵で多数の卵子および胚を得られることが可能となったが,多胎妊娠を防止する観点から移植胚数は原則1個とされている。そのため,複数個の胚が得られた患者は移植胚を選別する必要があり,適切に胚を評価,選別することは患者の出産までの期間と費用の削減に繋がる。近年,胚盤胞評価方法は,形態的評価やタイムラプスインキュベーターによる形態動的データを用いた評価に代わり,胚の細胞を一部採取し次世代シークエンサーなどにより胚の染色体正常性を判定したうえで胚移植を行う遺伝的評価が加わり生産率の向上に寄与している。しかしながら,遺伝的評価は細胞を採取する必要があり胚への侵襲的なダメージが危惧されている。そこで,胚を培養した培養後培地(Spent culture medium: SCM)に含まれる胚由来のcell-free DNA(cf-DNA)が新たな遺伝的評価ソースとして着目されている。SCM中には,胚ゲノム由来のcf-DNA(cf-nDNA)の他にミトコンドリアゲノム由来のcell free mitochondrial DNA(cf-mtDNA)が存在しており,SCM中のcf-mtDNAは,cf-n-DNAと比較して約数百倍の量が検出される。これまでのヒト胚を用いた研究では,分割期胚(Day3)におけるSCM中のcf-mtDNAが多いほど,その後の胚盤胞発生率および分割期胚移植における着床率が高いことが報告されている。しかしながら,胚盤胞期胚まで培養したSCM中のcf-mtDNAと胚盤胞の品質との関係性およびタイムラプスインキュベーターにより得られる形態動的データとの関係性について調査した報告はない。本研究は,SCM中に含まれるcf-mtDNAが胚盤胞の評価や移植のための胚選別に利用可能か否かについて明らかにするため,ブタ単為発生胚およびヒト胚を培養したSCM中に含まれるcf-mtDNAをリアルタイムPCRにより定量し,胚との関係性について解析した。まず,SCM中のcf-mtDNA量の測定として適切な条件や傾向を明らかにするために,ブタ単為発生胚を用いてSCM中のcf-mtDNA量と透明帯の有無,胚の細胞数,異なるploidy(倍数性)との関連性を解析した。その結果,SCM中に含まれるcf-mtDNA量は,胚の細胞数,透明帯の存在に影響しないことが示された。一方で,SCM中のcf-mtDNAは,Day2やDay3よりもDay4やDay7に有意に多く,二倍体胚に比べて一倍体胚において有意に多いことが示された。これらの結果により,SCM中のcf-mtDNAは胚の細胞数や透明帯の存在に影響されずに胚のploidyを評価するソースとして利用できる可能性が示唆された。つぎに,ヒト胚を培養したSCM中に含まれるcf-mtDNA量が拡張胚盤胞の評価および選別に利用できるか否かについて解析した。また,タイムラプスインキュベーターで培養した胚のSCMを用いることで,胚の挙動および形態動的データとSCM中のcf-mtDNA量の関係について調査した。SCM中のcf-mtDNA量は,患者年齢,AMH値,BMI,累積採卵回数および移植回数と有意な相関は認められず,またGardner分類に基づくICMおよびTEの形態評価の違いにおいても差は認められなかった。さらに,cf-mtDNA量は,媒精方法および培養日数(Day5or6)の違いにおいても有意な差は認められなかった。一方で,胚の動的パラメーターのうち,tEB(拡張期胚盤胞)–tSB(胞胚腔形成開始)およびtEB(拡張期胚盤胞)–tB(拡張前胚盤胞期胚)の所要時間においてcf-mtDNA量と正の相関が認められた。これらの時間は胚盤胞の拡張に要した時間(拡張時間)に相当しており,拡張時間が長い胚ほどSCM中のcf-mtDNA量が多いことが示された。

また,胚盤胞の収縮(blastocyst collapse: BC)現象が起きた胚におけるcf-mtDNA量はBCが起きていない胚と比べて有意に多いことが示され,BCの回数とcf-mtDNA量が有意な正の相関関係にあることが示された。さらに,BCが起きた胚は,BCが起きなかった胚と比較して拡張時間(tEB-tSB, tEB-tB共に)が有意に長いことが示された。これらの結果は,対象胚を形態良好胚のみに限定した場合であっても同様の傾向が確認された。以上の結果から,SCM中のcf-mtDNAは,胚盤胞の拡張過程において発生したBC現象により,胞胚腔液に多数蓄積しているcf-mtDNAが胚体外へ放出されていることが考えられた。

また,既報ではBCが起きた胚の移植後の妊娠率および生産率が有意に低下することや,拡張時間(tEB-tSB)の所要時間が遅延した胚の正倍数性率が低下することが報告されていることから,拡張時間とBCと相関するSCM中のcf-mtDNAは胚盤胞の質を評価するネガティブマーカーとして利用できる可能性が示唆された。

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