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Development of Monoclonal Antibodies and Antigen-Capture ELISA for Human Parechovirus Type 3

後藤 慶子 横浜市立大学

2021.03.25

概要

1. 序論
　ヒトパレコウイルス3型（HPeV3）は, ピコルナウイルス科パレコウイルス属に属する一本鎖プラス鎖RNAウイルスの一種である．ピコルナウイルス科にはライノウイルス, ポリオウイルス, エコーウイルス, A型肝炎ウイルス, コクサッキーウイルス, エンテロウイルス71型など, ヒトに様々な疾患を引き起こす病原体が含まれるが, 中でもHPeV3感染症は, 新生児や乳児において, 髄膜炎や敗血症様症状などの重篤な症状を引き起こす点で特徴的である（Britton et al., 2016）．HPeV3は発見から20年ほどしか経っておらず, ウイルス学的に不明な点が多く, 治療法や早期診断法が確立していない現状にある．現在, リアルタイムPCRを用いた遺伝子検査法が開発されているが, 臨床検体からのウイルス核酸抽出が必要である．一方, 検体の取り扱いが容易な抗原検査法は存在しない．HPeV3の抗原検査法を確立する上で, HPeV3の特定のウイルス抗原に対して高い特異性を示すモノクローナル抗体（mAb）を開発することは重要な課題の一つであるが, 現在のところ, HPeV3抗原を特異的に認識するmAbや抗原検出法の報告はほとんどない．また, HPeV3の類縁ウイルスであるエンテロウイルスは臨床症状の共通点も多いことから, 臨床症状から原因ウイルスを特定することは難しい．したがって, エンテロウイルスと交差反応しない検出方法を開発することが不可欠である．
　そこで, 本研究では, HPeV3の構造タンパク質VP0に特異的なmAbを開発し, その特性を調べると共に, mAbを用いたHPeV3特異的な酵素免疫測定法（ELISA法）を構築することを目的とした．

2. 実験材料と方法
　HPeV粒子は, エンベロープを持たず, カプシドと呼ばれる3つの構造タンパク質（VP0, VP1およびVP3）と, 7つの非構造タンパク質（2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cおよび3D）から形成されるが, これらの中で, VP0は高い免疫原性を有することも知られており, 比較的遺伝子配列も保存されている（Abed et al., 2007; Shakeel et al., 2017）．そこで, ウイルスタンパク質の可溶化率が高く, 機能を維持した状態を保ちやすいという性質がある小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用い, HPeV3 VP0タンパク質を作成, 精製した．合成したHPeV3 VP0タンパク質を免疫原としてマウスに接種後, 脾臓細胞とミエローマ細胞を融合し, 48種のハイブリドーマクローンを得た．得られたハイブリドーマクローンから, HPeV3 VP0タンパク質を抗原としたELISA法により, 反応性が良いmAbを選択した．選択したmAbについては, HPeV3 VP0欠失変異体を用いたウェスタンブロット法によるエピトープマッピング解析により, mAbが認識する領域を特定した．また, 他のHPeV VP0および2種類のエンテロウイルスに対する交差性について, VP0領域の合成タンパク質を用いて確認した．更に, 選択したmAbを用い, HPeV3抗原を検出するサンドイッチELISA法を開発するため, 最も適したmAbの組み合わせを検討し, 組換えHPeV3 VP0タンパク質およびHPeV3を用い, 検出を試みた．併せて, 10種類のエンテロウイルスに対する交差反応性を確認した．

3. 結果
　得られたハイブリドーマクローンから, HPeV3 VP0タンパク質に反応するmAbをELISA法により9つ（＃3, ＃6, ＃8, ＃12, ＃27, ＃30, ＃34, ＃39および＃41）を選択した．HPeV3 VP0欠失変異体を用いたウェスタンブロット法によるエピトープマッピング解析により, これらのmAbはHPeV3 VP0タンパク質の3つの異なる領域を認識することが明らかとなった．具体的には, ＃30および＃34はVP0の68から121アミノ酸（aa）を認識し, ＃3, ＃8および＃27は127から172aaを認識した．また, ＃6, ＃12, ＃39および＃41は, VP0のC末端領域内の225から289aaを認識した．9つのmAbのうち, 6つのmAb（＃3, ＃6, ＃8, ＃12, ＃27および＃39）はHPeV3を特異的に認識し, 3つのmAb（＃30, ＃34および＃41）は他のHPeVとの交差反応性を示した．いずれのmAbも2種類のエンテロウイルスと交差反応性を示さなかった．
　次に, HPeV3抗原を検出するサンドイッチELISA法を開発するために, HPeV3を特異的に認識する6種類のmAbの中から, 抗原捕捉に最適なmAbの組み合わせ（＃8および＃39）を決定した．これらのmAbのVP0抗原に対するKD値は, ＃8は1×10-12, ＃39は3.72×10-10であり, 両mAbがVP0に対して高い結合親和性を示すことがわかった．本研究で構築したELISA法は, 組換えVP0タンパク質は3ng/mL以上を検出し, HPeV3を1×109コピー/mL以上の濃度で検出した．また, このELISA法では, HPeV3のみを特異的に検出し, 他の10種類のエンテロウイルスとの交差反応性を示さなかった．

4. 考察
　一般的に, HPeVは軽度の呼吸器症状や胃腸炎症状を引き起こすことが知られているが, 重症感染症を引き起こすHPeV3のメカニズムは明らかとなっていない．その一つの要因は, 他のピコルナウイルスやHPeVのカプシドタンパク質に見られるRGDモチーフと呼ばれる受容体結合領域がHPeV3では欠失しており, HPeV3の細胞侵入機構や感染細胞指向性などのウイルス学的な知見が乏しいためである（Nelson et al., 2017）．
　本研究で我々が開発した抗体クローンには, HPeV1を含むpan-HPeVを検出するものと, HPeV3特異的に検出するものが含まれていた．一部のmAbは, 免疫蛍光抗体法および免疫沈降法にも適応可能であった．これらを用いることにより, HPeV感染細胞をそれぞれ検出できるようになり, HPeV3感染細胞の検出などウイルス学的研究を行う上での重要なツールに成り得る．また, 今回開発したmAbクローンや抗原捕捉ELISA系は, 今後HPeV3迅速診断法の確立のための重要なツールとなることが期待される．

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