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Dysbiosis of the salivary microbiota in pediatric-onset primary sclerosing cholangitis and its potential as a biomarker

岩澤 堅太郎 横浜市立大学

2021.06.30

概要

1. 序論
　原発性硬化性胆管炎（Primary Sclerosing Cholangitis，PSC）は, 肝内および肝外胆管の慢性炎症と線維化によって，胆管の多発性の狭窄と拡張をきたし，最終的には胆汁性肝硬変に至る予後不良な肝疾患である（Dyson et al., 2018）．潰瘍性大腸炎（Ulcerative colitis, UC）をはじめとする炎症性腸疾患を合併する頻度が高く，その発症要因に腸内細菌の関与も指摘されている．成人ではPSCの腸内細菌叢において，Veillonella属などの口腔内で主要な細菌が増加していたことが報告されたが（Kummen et al., 2017），これまでにPSCの口腔内細菌叢の報告はなく, 本研究ではPSC患者の口腔内細菌叢と小児期発症 PSCの腸内細菌叢の解析を目的として, PSC患者，PSC非合併UC患者，健常者（Healthy control, HC）の唾液および糞便の細菌叢構造を比較検証した.

2. 実験材料と方法
　2013 年 5 月～2015 年 10 月の間に済生会横浜市東部病院を受診し,発症時年齢が 18 歳未満であった PSC 患者（PSC 群）, PSC 非合併 UC 患者（UC 群）および健常者（HC 群）の唾液および糞便を採取した後に, 迅速に嫌気パックし, グリセロール・ストックにより凍結保存することで細菌叢の構成を維持した. 細菌 DNA を調製し, 16S リボソーム RNA 遺伝子 V1-V2 領域を PCR 増幅し Roche 454 GS シリーズを用いた塩基配列の決定を行った. α多様性の評価として, Operational Taxonomic Units (OTU)数，Chao1 index，Shannon’s index, また, β多様性の評価として, UniFrac 距離解析を用いた細菌叢の系統樹に基づく菌叢構造の類似度を評価した. また，各群における菌種の門・科・ 属・種レベルの組成比を比較した．さらには，唾液細菌叢の菌種の組成比用いて，機械学習であるランダムフォレストを行い, 得られた Out-of-back エラー率により受信者動作特性（Receiver Operating characteristic curve，ROC）曲線を作成し, その曲線下面積（Area under the curve，AUC）で診断能を評価した.

3. 結果
　サンプル提供の協力を得られたのは，PSC 群は 27 例（男 19 例, 女 8 例），UC 群 16 例（男 7 例, 女 9 例）, HC 群 24 例（男 10 例, 女 12 例）であった．また，PSC 群の全例に消化管病変を認め, UC 10 例（42%）, 非特異的腸炎 17 例（59%）であった. PSC 群は，腸内細菌叢の Unweighted UniFrac 距離解析，および，唾液細菌叢の Weighted UniFrac距離解析で UC 群とも HC 群とも有意に異なったクラスターを形成した．一方で，PSC 群の腸内細菌叢では Shannon’s index が HC 群と比較して有意に低かったが(p＜0.05)，唾 液細菌叢では Shannon’s index を含むα多様性の指標に差を認めなかった．これらの結果は，PSC 群において，腸内細菌叢では菌種の多様性が減少し，IBD や他の腸内細菌叢の恒常性破綻を来す病態と同じ傾向であることを示唆する一方で，唾液細菌叢においては，菌種数の多様性は保たれているものの，主要細菌菌種の組成比が変化していることを示唆した．腸内細菌叢では，PSC 群は，HC 群と比較して，Enterococcus*属が増加し， Parabacteroides*属が減少しており，UC 群と比較して，Ruminococcus*属， Faecalibacterium*属，Roseburia*属が増加していた．唾液細菌叢では, PSC 群は，HC 群に比較して, Rothia*属と Haemophilus**属が減少しており, UC 群と比較して, Haemophilus***属の減少と Oribacterium**属の増加を認めた（*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001）.唾液細菌叢の菌属の組成比を用いると PSC 群と HC 群は AUC 0.7423, PSC群と UC 群は AUC 0.8756 で分けることができ，菌種の組成比を用いると PSC 群と HC 群は AUC 0.8011, PSC 群と UC 群は AUC 0.7626 で分けることができた（表 1）．

4. 考察
　小児期発症の PSC において，腸内細菌叢および唾液細菌叢の菌叢構造は崩れており，その主体は，腸内細菌叢は菌種数の低下で，唾液内細菌叢は主要細菌の組成比の変化であった唾液細菌叢は,口腔内疾患のみならず, 炎症性腸疾患を含めた（Said et al. 2014）様々な 全身疾患でもその関連が報告されている. 唾液細菌叢は糞便と比較して採取が簡易で，抗菌薬をなどの環境の影響を受けにくく，侵襲性の低いバイオマーカーとして利用できる可能性が考えられている. 我々の検討においても PSC と HC を 13 菌種により AUC 0.8011 で, PSC と UC を 6 菌属で AUC 0.8756 で区別することができ，診断的バイオマーカーとなりうることを示唆した．今後，様々な国や地域, 合併する IBD の種類，成人期発症の症例も含めた PSC 唾液細菌叢データの蓄積が望まれる.

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