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In vitro 代謝試験系およびヒト肝細胞キメラマウスを用いたフェルバメートの反応性代謝物生成メカニズムの解析

佐藤 公也 広島大学

2022.08.29

概要

<序論>
 フェルバメート(felbamate, FBM)は1993年に米国食品医薬品局(US Food and Drug Administration, FDA)により承認された抗てんかん薬である。FBMは,実験動物を用いた非臨床試験及びヒトにおける臨床試験では顕著な毒性を示さなかった一方,市販後に,重篤な肝毒性及び骨髄毒性が発生し,黒枠警告(black box warning)が発せられた。これまでの研究により,FBMは第一段階目の代謝として,酸化あるいは加水分解を受けることが報告されている。また,加水分解を介して,反応性代謝物とよばれる,反応性に富んだ代謝物2-phenylpropenal(2-PP)が生成し,それにより肝毒性を発症することが示唆されている。しかしながら,FBMの代謝に関与する薬物代謝酵素を含め,肝毒性の発現に至るメカニズムについては,これまでのところ十分な検討がなされていない。
 本研究では,FBMの反応性代謝物生成メカニズムの解明及び臨床におけるより安全なFBMの使用に貢献することを目的としてIn vitro試験及びIn vivo試験を実施した。
 In vitro試験においては,ヒトのcytochrome P450(CYP)及びcarboxylesterase(CES)の各分子種を発現させた発現系ミクロソームを用いて,FBMの酸化及び加水分解に関与する薬物代謝酵素について検討した。また,In vivo試験においては,マウス肝細胞の大部分がヒト肝細胞に置換されたヒト化動物モデルであるヒト肝細胞キメラマウス(PXBマウス;株式会社フヱニックスバイオ)を用いて,FBMの代謝物プロファイルを評価するとともに,反応性代謝物の解毒に重要な役割を担うと考えられるグルタチオン(glutathione, GSH)の変動について解析した。

<実験方法>
In vitro試験:
 FBM(10 μmol/L)を,ヒトのCYP及びCESの各分子種を発現させた発現系ミクロソームと120分間インキュベーションし,FBMの量を液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS)により測定した。120分後に残存するFBMの量を指標に,FBMの酸化及び加水分解に関与する薬物代謝酵素について検討した。
In vivo試験:
 ①FBMを600mg/kgでPXBマウスに単回経口投与し,2時間後の血漿及び肝臓を採取した。採取した試料をUV検出器付き液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置(liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with UV detector, LC-UV/MS)(こて分析し,FBMの代謝物プロファイルを評価した。
 ②FBMを600mg/kgでPXBマウスに単回経口投与し,24時間後の肝臓を採取した。採取した肝臓を凍結後に薄切して凍結肝切片を作成し,質量分析イメージング法(mass spectrometry imaging, MSI)により内因性GSHの変動を解析した。

<結果及び考察>
In vitro試験:
 FBMをCYP発現系ミクロソームとインキュベーションしたところ,残存するFBMの量はCYP2C8, CYP2C9及びCYP2E1発現ミクロソームで有意に低下した。また,FBMをCES発現系ミクロソームとインキュベーションしたところ,残存するFBMの量はCESlc発現ミクロソームで有意に低下した。これらの結果より,FBMの酸化代謝にはCYP2C8, CYP2C9及びCYP2E1が関与し,加水分解代謝にはCESlcが関与することが示唆された。
In vivo試験:
 ①FBMを投与後の血漿をLC-UV/MS分析したところ,未変化体及び10種類の代謝物が検出された。また,FBMを投与後の肝臓より,未変化体及び7種類の代謝物が検出された。これら検出された代謝物には,FBMの酸化及び加水分解で生成する代謝物に加え,2-ΡΡがGSH抱合を受けて生成する代謝物が複数含まれていた。これらの結果より,FBMをΡΧΒマウスに投与後、2-ΡΡが生成し,2-ΡΡはGSH抱合による解毒代謝を受けることが示唆された。
 ②ΡΧΒマウスより採取した肝臓をMSI分析し,内因性GSHの変動を解析したところ,FBMの投与によりGSHが減少傾向を示すことが確認された。この結果より,2-ΡΡを解毒代謝する過程で内因性GSHが減少し,そのことがFBMによる肝毒性に関与している可能性が示唆された。

く結論>
 In vitro試験において,FBMの酸化代謝にCYP2C8,CYP2C9及びCYP2E1が関与し,加水分解代謝にCESlcが関与することが示唆されたことから,CYP2C8,CYP2C9及びCYP2E1による酸化代謝が2-PPの生成を回避し,CESlcによる加水分解代謝が2-PPの生成につながる代謝経路となるものと考えられた。従って,CYP2C8,CYP2C9及びCYP2E1を介した薬物間相互や,CYP2C9の遺伝子多型は,FBMによる肝毒性のリスク要因となる可能性が示唆された。
 In vivo試験において,2-PPがGSH抱合を受けて生成する代謝物が複数検出されるとともに,FBMの投与により,肝臓で内因性GSHが減少することが確認された。これらの結果より,2-PPを解毒代謝する過程でGSHが減少し,そのことがFBMによる肝毒性に関与している可能性が示唆された。
 また,本研究を通して,PXBマウスは,ヒトの代謝物プロファイルに加え,GSHのような内因性物質の変動を評価可能なヒト化動物モデルであると考えられた。こうした点を踏まえると,PXBマウスは反応性代謝物による肝毒性のメカニズム解明やリスク評価を行う上で有用なヒト化動物モデルになるものと考えられた。
 本研究で得られた結果は,FBMの反応性代謝物生成メカニズムの解明及び臨床において,FBMをより安全に使用する上で有用な基礎的知見になるものと考えられる。

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参考文献

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