論文の公開元へPost-transcriptional regulation of ILC2 homeostatic function via Tristetraprolin
概要
1.序
2 型自然リンパ球（ILC2 ; Group 2Innate lymphoid cells）は抗原非特異的に 2 型免疫応答を誘導するリンパ球である。ILC2 は T 細胞や B 細胞でみられる抗原特異的受容体を持たない代わりに、微生物の侵入による上皮細胞等の損傷に伴って放出される IL-33 に応答して、p38 MAPK とGATA3 のリン酸化を介して IL-5、IL-13 といった 2 型サイトカインを多量に産生することで、好酸球浸潤や杯細胞からの粘液産生を誘導し、寄生虫排除やアレルギー病態の形成に重要な役割を果たす。一方、ILC2 は恒常的に微量の IL-5、IL-13 を産生することで好酸球＊の恒常性維持や腸管上皮幹細胞の自己複製に寄与することも知られている（図. 1）(1),(2)。ILC2 は疾患における役割などその生理的意義が精力的に研究されている一方で、細胞内分子メカニズムに関する研究には遅れが見られる。特に、恒常的な 2 型サイトカイン産生の制御機構や活性化時に多量の 2 型サイトカイン産生を可能にする機構については未解明な点が多く残されている。サイトカインの過剰産生は病態形成や恒常性破綻につながることから、その制御機構を理解することは ILC2 の生理的意義の本質を理解するうえでも必須である。
遺伝子発現は転写だけではなく、転写後のさまざまな機構によって制御を受けている。特に、サイトカインのように外来刺激によって発現が誘導される mRNA は半減期が短いことが知られており、転写後制御機構＊の重要性が近年明らかになってきている(3)。また、ILC2 の 2 型サイトカイン産生に必須の p38 MAPK は mRNA 輸送や安定性、翻訳といった複数の転写後制御機構に関与することが知られている。このような背景から、本研究では転写後制御機構に着目し、ILC2 の新規 2 型サイトカイン産生制御機構の解明を目指した。
2. 実験方法
1）実験動物
C57BL/6N マウスはチャールスリバー社および日本クレア社より購入した。γc-/-Rag2-/- マウス（#4111）と B6.SJL マウス（#4007）はタコニック社より入手した。Zfp36-/-マウスは CRISPR-Cas9 法により作製した。Zfp36 のエクソン 2 の上流を標的とした sgRNA を作製し、pUC18 ベクターにクローニングした（pUC18-Zfp36-gRNA）。C57BL/6N の受精卵へ Cas9 mRNA と pUC18-Zfp36-gRNA をインジェクションし、DNA シークエンスによりファウンダーマウスのスクリーニングを行った。PAM 配列の上流に 110 塩基の欠損が生じ、ナンセンス変異が生じたものを系統化した。本研究ではマウスは理化学研究所生命医科学研究センターまたは大阪大学大学院医学研究科の動物飼育室において SPF 環境下で維持、飼育された個体を用いた。全ての動物実験は各施設の動物実験委員会（Animal Care and Use Committees of RIKEN、Institutional Review Board of Osaka University）の承認を得ると共に、ガイドラインに従って実施した。
2) 腸間膜脂肪組織、肺及び小腸からの細胞単離
腸間膜は Liberase DH 含有培地で酵素処理後、GentleMACS により組織を破砕し、セルストレイナー（100um、37um）に通し、細胞を単離した。肺は Liberase TM 含有培地で酵素処理後、GentleMACS により組織を破砕し、セルストレイナー（100um）に通した。小腸は糞便とパイエル板除去後に EDTA 含有培地を用いた攪拌により上皮細胞を除去した。さらに、Collagenase Ⅳ含有培地で酵素処理後、GentleMACS により組織を破砕し、セルストレイナー（100um）に通した。肺と小腸については、GentleMACS 後に 30% Percoll 処理を行い、リンパ球を含む画分を回収した。ILC2 を単離精製する際、腸間膜、肺 ILC2 については Propidium Iodide（PI）陰性 Lineage 陰性 CD45.2 陽性 Thy1.2 陽性 ST2 陽性細胞、小腸 ILC2 については PI 陰性 Lineage 陰性 CD45.2 陽性 KLRG1 陽性 Sca-1 陽性細胞としてセルソーターAriaШを用いて分離した。*Lineage マーカーには抗 CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD11c、CD19、NK1.1、FcαRI、F4/80、Ter119、Gr-1 抗体を使用した。
3) RNAシークエンス解析
野生型マウスの腸間膜から単離した ILC2 を IL-33 存在下で 48 時間培養後、細胞から RNA を抽出し、TruSeq RNA sample preparation kit v2 を用いてライブラリー作製を行い、Hiseq1500 により塩基配列を決定した。EdgeR ソフトウェアを用いて発現変動遺伝子の抽出と MA plot の作成を行った。
4) フローサイトメトリー解析
肺 ILC2 は PI 陰性 Lineage 陰性 CD45.2 陽性 Thy1.2 陽性 ST2 陽性細胞、小腸 ILC2は PI 陰性 Lineage 陰性 CD45.2 陽性 KLRG1 陽性 Sca-1 陽性細胞、好酸球は PI 陰性Lineage 陰性 CD45.2 陽性 Siglec-F 陽性細胞と定義した。レトロウイルス感染後のILC2 を用いて細胞内染色を行う際は、細胞回収後に Intraprep（BECKMAN COULTER）を用いて IL-5、IL-13 の染色を行った。肺の細胞を用いて細胞内染色を行う際は、細胞調整後に BrefeldinA（Biolegend）含有培地を用いて 5 時間培養し、細胞表面抗原の染色後、Intraprep を用いて IL-5、IL-13 の染色を行った。
5) mRNAの安定性評価
IL-33 で 2 時間プレ刺激を行った ILC2 を p38 阻害剤と Actinomycin D 存在下で 0、0.5、1、2 時間培養した。レトロウイルス感染後 1 日目の ILC2 から AriaШを用いてGFP 陽性 ILC2 のみを単離し、Actinomycin D 存在下で、0、1、2、4 時間培養した。TTP 欠損ILC2 を Actinomycin D 存在下で 0、0.5、1、2 時間培養した。培養後、細胞から RNA 抽出を行い、RT-PCR により mRNA 発現を測定した。
6) レポーターアッセイ
Il5、Il13 mRNA の 3’ UTR を pGL3-promoter ベクターにクローニングし、FuGENE 6（Promega）を用いてマウス胎児線維芽細胞にトランスフェクションした。2 日後にDual-Luciferase Assay Kit（Promega）を用いてレポーターアッセイを行った。
3. 研究結果
1）IL-33 は p38 MAPK を介して Il5、Il13 mRNA を安定化する
ILC2 における 2 型サイトカインの遺伝子発現制御機構を明らかにするために、IL-33 刺激時の ILC2 における Il5、Il13の pre-mRNAと
mRNA の発現量、およびタンパク量を経時的に測定した。Il5 pre-mRNA 量は IL-33刺激後 3 時間でピークを向かえ、その後刺激前と同等まで減少するのに対し、Il5mRNA は IL-33 刺激後 72 時間でも刺激前と比較し発現量が高かった。一方で、Il13pre-mRNA と Il13 mRNA 量は IL-33 刺激時間依存的に増加した（図. 2A、2B）。また、タンパク量については IL-33 刺激により IL-5、IL-13 ともに定常時と比較し数百倍以上増加した（図. 2C）。以上のことから、IL-33 刺激による Il5、Il13 mRNA 発現と多量のタンパク産生には転写後制御などの転写以外のメカニズムが関与することが示唆された。IL-33 シグナル下流の p38 MAPK は転写後制御機構の一つであるmRNA の安定性制御に関与することから(4)、ILC2 における Il5、Il13 の mRNA 発現とタンパク産生に IL-33 による p38 MAPK を介した mRNA の安定化が寄与することが考えられた。そこで p38 阻害剤存在下で IL-33 刺激後の ILC2 における Il5、Il13mRNA の安定性を評価したところ、p38 阻害剤存在下では Il5、Il13 mRNA の安定性が有意に低下した（図. 2D）。以上の結果から、IL-33 は p38 MAPK を介して Il5、Il13 mRNA を安定化することが明らかとなった。
2）ILC2 は RNA 結合タンパク質 Tristetraprolin を高発現する
ILC2 の 2 型サイトカイン産生に関わる転写後制御関連遺伝子を同定するために、活性化ILC2 の RNA シークエンス解析を行った。その結果、RNA 結合タンパク Tristetraprolin（TTP）＊をコードする Zfp36 が活性化に伴い顕著な発現低下を示すことが明らかとなった（図.3A）。TTP は 3’ 非翻訳領域（3’ UTR）に AU リッチ配列（ARE）を持つ mRNA に結合し、その分解を誘導する。マクロファージや T 細胞において TNFα、IL-6 などの発現を制御することが知られているが、ILC2 における Zfp36 の発現はこれらの免疫細胞よりも高かった（図. 3B）。また、末梢組織常在性の ILC2 は臓器毎にその遺伝子発現に固有の特徴を持つことが知られているが、いずれの末梢組織に存在する ILC2も Zfp36 を高発現しており、TTP は末梢組織に存在する ILC2 に共通した制御因子であることが示唆された（図. 3C）。ILC2 における Zfp36 の発現は活性化に伴い低下することから、定常状態の ILC2 では TTP により転写後制御を介して Il5、Il13 の発現が抑制されており、活性化 ILC2 では TTP の発現が低下し、Il5、Il13 mRNA が安定化することで効率的な翻訳が行われているのではないかと考えられた。
3）TTP は Il5、Il13 mRNA を不安定化する
ILC2 における Zfp36 の発現は IL-33 刺激によって低下することから、TTP をILC2 に過剰発現させ、2 型サイトカイン産生への影響を細胞内染色により評価した。その結果、TTP を過剰発現させた ILC2 では IL5、IL-13 産生が顕著に抑制された（図. 4A）。Il5、Il13mRNA は TTP の標的配列である ARE を持っているため、TTP の過剰発現による ILC2 からの IL-5、IL-13 産生抑制が mRNA の分解によるものであることが考えられた。そこで、TTP 過剰発現 ILC2 における Il5、Il13 mRNAの安定性を評価したところ、コントロールと比較して Il5、Il13 ともに mRNA の安定性が有意に低下した（図. 4B）。また、活性化 ILC2 における Il5、Il13 mRNA は分解が少なく極めて安定していた（図. 4B）。次に、Il5、Il13 mRNA が TTP の標的であるかどうかを、これらの mRNA の 3’ UTR を用いてレポーターアッセイにより検証した。マウス胎児線維芽細胞に目的の mRNA の 3’ UTR を組み込んだルシフェラーゼベクターを TTP過剰発現ベクターとともにトランスフェクションしたところ、Il5 の3’ UTR を組み込んだ場合のみ、有意にルシフェラーゼ活性が低下した（図. 4C、4D）。このことから、Il5 mRNA は TTP の標的である一方で、Il13 mRNA は TTP の標的ではなく、ILC2 においては間接的に制御されていることが示唆された。
4）TTP 欠損マウスでは ILC2 からの恒常的な IL-5、IL-13 産生が亢進する
生理的条件下でのILC2におけるTTPの役割を明らかにするために、CRISPR-Cas9法によりTTP欠損マウスを作製した。TTPは定常状態の ILC2 における抑制分子として機能することが考えられたため、TTP欠損マウスの肺と小腸からILC2を単離し、生存シグナルであるIL-7存在下で培養することで、定常状態のILC2からのサイトカイン産生をELISA により評価した。その結果、肺、小腸どちらのTTP欠損 ILC2 においても IL-5、IL-13 産生が亢進した（図.5A）。ILC2 からの恒常的な IL-5 産生は小腸の好酸球の恒常性維持に寄与するため、肺と小腸の好酸球数について評価したところ、TTP欠損マウスの小腸でのみ好酸球数が有意に増加した（図.5B）。さらに、TTP欠損マウスではILC2からのみIL-5産生が亢進しており、好酸球の恒常性維持にはILC2におけるTTPによるIL-5の遺伝子発現制御が重要であることが明らかとなった（図. 5C）。次に、TTP 欠損マウスにおける ILC2からの IL-5、IL-13 産生の亢進が Cell intrinsic なものであるのかどうかを検証するために、コンジェニックマウスを用いた競合的骨髄移植を行った。ILC2 からの 2 型サイトカイン産生を細胞内染色により評価したところ、TTP 欠損マウスの結果と一致して、TTP 欠損骨髄由来の ILC2 でのみ IL-5、IL-13産生が亢進しており、TTP欠損マウスにおける ILC2 からの IL-5、IL-13 産生の亢進は Cell Intrinsic なものであることが明らかとなった（図.5D、5E）。最後に、TTP欠損 ILC2 における Il5、Il13mRNA の安定性を評価した。Il5 mRNA は TTP 欠損 ILC2 で有意に安定化されたが、Il13 mRNAはわずかに安定化されており、TTPは mRNA 分解だけでなく、他のメカニズムを介して Il13 を制御することが示唆された（図.5F）。以上の結果から、TTPは mRNAの分解を介して ILC2 からの恒常的な IL-5 を直接、また、IL-13 産生を間接的に制御することが明らかとなった。
4.討論
本研究から ILC2 の恒常的な IL-5、IL-13 産生は TTP により mRNA の安定性を介して制御されていることが明らかとなった。TTP 欠損マウスでは ILC2 からの恒常的な IL-5、IL-13 産生が亢進し、好酸球の恒常性が破綻していたことから、TTP によるILC2 の IL-5、IL-13 産生制御は生体の恒常性維持において重要な役割を果たすと考えられる。また、活性化 ILC2 では TTP の発現低下により Il5、Il13 mRNA が安定化しているため、翻訳が効率的に起こり、多量なタンパク産生が可能となるのではないかと考えられる（図. 6）。真菌感染において肺胞洗浄液中の IL-33濃度は感染後 1 時間でピークを迎えるにもかかわらず、ILC2 からの IL-5、IL-13 産生は感染後 48 時間後でも維持されていることが報告されており (5)、ILC2 の 2 型サイトカイン産生における転写後制御は恒常性維持だけではなく、生体内での持続的な 2 型炎症においても重要な役割を果たすと推察される。
本研究では 3 型自然リンパ球（ILC3 ; Group 3 Innate lymphoid cells）も ILC2 同様にTTP を発現することが明らかになった（図.3B）。ILC3 は恒常的に IL-22 を産生し、IL-22 は TTP の標的 mRNA である(6)。抗原特異的に活性化する T 細胞とは異なり、さまざまな環境因子に応じてサイトカインを産生する ILC においては、TTP による転写後制御機構が重要な役割を果たしている可能性がある。そのため、転写後制御機構に着目したさらなる研究は ILC の生態及びその生理的意義の理解を一層深めることにつながると期待される。
5.まとめ
1）ILC2 において IL-33 は p38 MAPK を介して Il5、Il13 mRNA を安定化する
2）TTP は naïve ILC2 に高発現しており、活性化 ILC2 では発現が低下する
3）TTP は Il5、Il13 mRNA を不安定化する
4）TTP 欠損マウスでは ILC2 からの恒常的な IL-5 産生が増加し、好酸球の恒常性が破綻する
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