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In silico analysis of inner ear development using public whole embryonic body single-cell RNA-sequencing data

Yamamoto, Ryosuke 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23750

2022.03.23

概要

内耳上皮は蝸牛・前庭・三半規管・内リンパ管の四つの構造で構成される。これらの構造はマウスでは胎齢13.5日には明瞭に分かれる一方で、内耳が耳胞と呼ばれる胎齢10.5日にはまだ明確に分かれていない。本研究では、Mouse Organogenesis Cell Atlasと呼ばれる胎生期マウスの全身の細胞の単一細胞トランスクリプトームの公開アトラスの一部を利用し、内耳発生早期の各種細胞に特異的に発現するマーカー遺伝子を同定することを目的とした。胎齢9.5–13.5日の全身の細胞の200万個の単一細胞トランスクリプトームデータから内耳上皮細胞と考えられる5,000個の細胞のデータを抽出した。まず全身の細胞を遺伝子発現情報から分類しEpcamやTrp63を発現する上皮細胞の集団が特定された。その後、上皮細胞の細胞集団を同様に分類したところ、他の細胞群と明瞭に分かれる細胞集団が存在し、その細胞集団が、内耳に特異的に発現するOtol1,Oc90などを発現していたことから内耳上皮細胞と考えられた。5,000個の細胞の高次元情報を二次元に落とし込み可視化したところ、胎齢9.5日の細胞から胎齢13.5日へと分化が進むにつれて、辺縁に分布し、大きく四つのクラスターを形成していくことがわかった。それらのクラスターを胎生期内耳での発現分布が既知の遺伝子の発現を参考にしながら、データのアノテーションを行ったところ、それぞれが蝸牛・前庭・三半規管・内リンパ管に相当することがわかった。また、各クラスターの中に、感覚上皮などのサブクラスターを検出できることがわかった。in silico解析の妥当性を確認するために、各クラスターに特異的に発現していると検出された遺伝子の中から内耳での発現がわかっていない遺伝子を選び、蝸牛・前庭・三半規管・内リンパ管での発現を、in situ hybridizationで確認したところ、in silico解析結果と同様の発現分布を認めた。胎齢10.5日では、蝸牛と前庭を組織学的に区別することが難しく、両者を区別するようなマーカー遺伝子も見つかっていなかったが、in silico解析の結果、胎齢10.5日でも蝸牛と前庭のクラスターは明瞭にわかれていると考えられた。胎齢10.5日から13.5日にかけて蝸牛のクラスターに特異的に発現すると考えられた遺伝子Rorbのin situ hybridizationを行ったところ、胎齢11.5日から13.5日にかけて、Rorbが蝸牛に特異的に発現することを確認し、また胎齢10.5日においては蝸牛と前庭の区別をする指標がないものの、蝸牛が出現してくると考えられる耳胞腹側端に特異的にRorbが発現することがわかった。これらの結果から、胎齢10.5日において既に蝸牛の分化が始まっていることが示唆され、またRorbは蝸牛前駆細胞と前庭前駆細胞を区別するマーカー遺伝子である可能性が示された。

 以上のように、公開された単一細胞トランスクリプトームデータを再解析することで、内耳発生早期の細胞を分類するとともに、各細胞群を特徴づけるマーカー遺伝子候補を検出した。また、胎齢10.5日の時点で、蝸牛や前庭を遺伝子発現情報から分類できることがわかった。胎齢10.5日の蝸牛と前庭を比較して見つかった発現変動遺伝子の中に、蝸牛や前庭の発生機構に関わる遺伝子が含まれている可能性があり、今後各遺伝子の機能を明らかにする研究が望まれる。また、本研究で見つかった各クラスターのマーカー遺伝子の知識が、内耳発生早期の研究を更に促進することが期待される。

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