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Prostaglandin E2 receptor EP4 regulates cell migration via Orai1

大澤 昂平 横浜市立大学

2020.03.25

概要

【序論】
　口腔癌は，近年大幅な生存率の改善が認められる．しかし，進行口腔癌では依然として予後が不良であり，集学的治療の進歩にもかかわらず，5年生存率は約60%である．また，頸部リンパ節転移は予後を決める最も重要な因子の1つであり，口腔癌の進行ステージと関連している．現在，外科療法が口腔癌の標準治療であるが，進行口腔癌では特に術後の機能障害や整容的障害など様々な合併症が問題となっている．近年，臓器温存や機能温存のために，化学放射線療法や分子標的薬を用いた治療も行われている．しかし，化学放射線療法は血液毒性，重度口腔粘膜炎による嚥下障害などの急性の有害事象，顎骨の壊死などの晩期の有害事象を引き起こすことがある．これらのことより，現在口腔癌治療に求められているのは，有害事象が少なく確実に癌の局所制御を行うとともに，癌細胞の遊走能や遠隔転移の抑制を行える治療方法である．
　一方，EP4はProstaglandin E2(PGE2)受容体の1つである．PGE2は代表的な炎症性サイトカインであり，その受容体にはEP1，EP2，EP3，EP4が報告されている．PGE2とがんの関連性については1990年代始めにPGE2産生物質であるCyclooxygenase(COX)阻害薬であるアスピリンが大腸がんの発生を抑制したという報告から始まる(Thun MJ et al., 1991)．当教室ではこれまでに総説の中でEP4が大腸がんや肺がんで細胞遊走能や転移に深く関わっていることをまとめた(Yokoyama et al., 2013)．しかし，EP4とがんの遊走能についての報告数は少なく，口腔がんにおいてはさらに少ない．またEP4とCa2+シグナルについての報告は口腔がんに限らず数扁の報告があるのみである．過去に細胞内Ca2+の上昇ががん細胞の遊走や転移に関与することが報告されている(Umemura et al., 2014)．
　今回，我々は口腔がん細胞の遊走におけるEP4の関与，およびCa2+シグナル伝達に注目し，がん細胞遊走におけるメカニズムについて検討した．

【方法】
　ヒト口腔扁平上皮がん細胞株HSC-3およびOSC-19，shRNAレンチウイルスでEP4，Orai1，STIM1をそれぞれノックダウンしたHSC-3細胞株，ヒト神経膠芽腫細胞株LN229，ヒト転移性乳がん細胞株MCF-7，ヒト心臓線維芽細胞株HCFを用いて実験した．薬剤はPGE2，ONO-AE1-437(EP4 agonist)，ONO-AE3-208(EP4 antagonist)，LY294002(PI3K inhibitor)，PKI-(14-22)-amide(PKA inhibitor)，U0126(MEK inhibitor)，YM58483(SOCE inhibitor)，Xestospongin C(IP3 receptor antagonist)を使用した．Scratch assayで細胞の遊走能を評価した．また，細胞の増殖が遊走能に影響していないか2，3，-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt(XTT)で増殖能を評価した．EP4ががん細胞の遊走能に影響している結果が得られたため，転移能にも影響があるか調べるためにEP4ノックダウン細胞を使用して動物実験を行った．ヌードマウスに口腔がん細胞を尾静注し，肺転移モデルを作成し，CTで経時的に肺転移を評価した．尾静注後5週後で肺を摘出し，ホルマリン固定を行った．肺の腫瘍転移巣であると思われる結節をカウントし，EP4ノックダウンによる転移能への影響を検討した．また，病理切片を作成し，Hematoxylin-Eosin染色を行い結節が転移巣であることを確認した．
　メカニズム解析の実験では細胞内Ca2+流入をカルシウムイオン感受性色素である1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N，N，N'，N'-tetraacetic acid(Fura-2)を用いて評価した．EP4刺激時に細胞内Ca2+流入が認められたため，EP4とCa2+チャネルに相互作用があると仮説を立て，免疫沈降でEP4と相互作用する蛋白質の同定を行った．Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)，Western blot法でEP4刺激時の遺伝子発現，蛋白質発現の変化を評価した．Gelatin zymographyでがんの浸潤に関わるMMP-2，MMP-9の活性化を評価した．

【結果】
　まずRT-PCRとWestern blot法でHSC-3とOSC-19にEP4が発現していることを確認した．次にScratch assayでEP4agonistが口腔がん細胞の遊走能を亢進させることを実証した．また，PGE2刺激で亢進した遊走能をEP4antagonistが抑制すること，EP4ノックダウンによって有意に遊走能が低下することを確認した．EP4が口腔がん細胞の遊走能に関わる結果が得られたため，肺転移モデルマウスを使用してEP4の転移能への影響を調べたところEP4ノックダウン細胞では，有意に転移能が低下することが明らかになった．
　さらにEP4と遊走能亢進のメカニズムを調べるために遊走能亢進との関わりが報告されているCa2+に注目し，実験を行った．Fura-2でEP4刺激時の細胞内Ca2+上昇を確認した．EP4刺激時の細胞内Ca2+上昇はLN229，MCF-7，HCFでも確認できた．EP4の下流のシグナルを調べると，PKA inhibitorではEP4刺激時の遊走能亢進，細胞内Ca2+上昇を抑制しなかったのに対し，PI3K inhibitorがこれらを抑制した．このことからEP4による遊走能亢進，細胞内Ca2+上昇はPI3Kを介していることが示唆された．一方でEP4とCa2+の関わりが示唆されたため，免疫沈降でEP4と相互作用のある蛋白質を調べたところCa2+チャネルであるOrai1と相互作用があることが確認できた．そこでshRNAレンチウイルスを使用し，Orai1ノックダウン口腔がん細胞を作成し，その細胞を用いてEP4刺激時の遊走能，細胞内Ca2+を評価した．Orai1ノックダウン細胞ではEP4刺激でも遊走能は亢進せず，細胞内Ca2+上昇も生じなかった．また，Orai1とSOCEを構成する分子であるSTIM1とEP4の相互作用も検討したが，免疫沈降で相互作用が認められず，STIM1をノックダウンした細胞ではEP4刺激時の遊走能亢進，細胞内Ca2+上昇が生じた．このことからEP4はSTIM1を介さず，Orai1と直接相互作用することが示された．
　最後に，蛋白質発現を確認したところ，EP4刺激によって遊走能と深く関わりのあるERKのリン酸化が生じた．さらにERKのリン酸化はOrai1をノックダウンした細胞ではEP4刺激時でも生じなかった．また，EP4刺激によってがんの浸潤に関わるMMP-2，MMP-9の遺伝子発現が上昇し，活性が上昇した．
　これらのことからEP4は口腔がん細胞の遊走，転移に深く関わっていることが示され，そのメカニズムとしてOrai1を介した細胞内Ca2+流入が生じていることが明らかになった．

【考察】
　EP4は大腸がんなどの増悪因子として知られているがそのメカニズムまでは不明である．本研究でEP4がSTIM1を介さず，直接Orai1と相互作用し，細胞内Ca2+を調節することで細胞遊走を亢進させることを実証した．この報告は他部位のがんや正常細胞でも報告がなく，今後のがん治療の発展に大きく関わることが考えられる．現在の研究でEP4がTRPC1と相互作用することも確認できており，他の因子が関わっている可能性も示唆されている．今後はさらなるメカニズム解明と臨床応用に向けた研究を進めていく．

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