論文の公開元へThe Daple-CK1ε complex regulates Dvl2 phosphorylation and canonical Wnt signaling
概要
【緒言】
β-catenin活性を主とする古典的Wntシグナル経路は、細胞内の機能、細胞間コミュニケーション、胚発生、組織の恒常性、腫瘍の発生と進行等に関与している（Nusse., et al, Cell, 1992）。古典的Wntシグナル経路は、19種類存在するWntのうちWnt3aが７回膜貫通タンパク質のFrizzledと結合することで始まる。Wnt-Frizzled複合体は細胞内に存在する足場タンパク質のDishvelled 2（Dvl2）を細胞膜にリクルートし、Dvl2はCasein Kinase（CK）1εといったキナーゼによってリン酸化される（Peters., et al, Nature, 1999）。リン酸化Dvl2は、β-cateninのリン酸化とユビキチン化を促進するDestruction complex（Axin、Glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）とadenomatous polyposis col（APC）等で構成される）の機能を阻害し、β-cateninが活性型の状態を維持する。しかし、CK1εによるDvl2のリン酸化機構は未だに十分に理解されていない（Sharma., et al, Cellular Sig, 2018）。本研究では、Dvl2の結合タンパク質の一つである、足場タンパク質のDaple(Dishvelled-associating protein with a high frequency of leucine residues）に着目することで、本課題を解決した。
DapleはDvl2の結合タンパク質として同定され（Oshita., et al, Genesto Cells, 2003）、特に、DapleのC末端アミノ酸のGlycine-Cytosine-Valine（以下：GCV）とDvl2が結合することが知られている（Ishida-Takagishi., et al, Nat Commun, 2012）。加えて、DapleがDvl2のリン酸化を促進することも示唆されている（Oshita., et al, Genesto Cells, 2003）。一方で、DapleによるDvl2のリン酸化と関連するキナーゼと、DapleによるDvl2のリン酸化部位の同定、加えて当該リン酸化Dvl2の機能は全く解明されていなかった。本研究では、生化学的実験手法を軸に、上記の問題解決に取り組んだ。
【方法】
細胞株はヒト胎児腎細胞（Human Embryonic Kidney cells：HEK）293株を用いた。またタンパク質発現量の評価にはウェスタンブロッティング、β-catenin活性の評価にはルシフェラーゼレポーターアッセイを用いた。
【結果】
現在、Dvl2の143番目のSerine（Ser143）と224番目のThreonine（Thr224）のリン酸化を認識する抗リン酸化Dvl2抗体のみ研究試薬として普及している。また、Dvl2のSer143のリン酸化は古典的Wntシグナル経路を促進することが報告されている（He., et al, Sci Rep, 2016）。従って、本研究では、DapleとDvl2のThr224の関係性について着目した。
野生型Dapleの過剰発現では、Dvl2（Thr224）のリン酸化が亢進したが、Dvl2との結合に必須であるGCVドメインが欠損した変異型Dapleでは当該Dvl2リン酸化が確認されなかった（Fig.1A）。Dvl2におけるThr224のリン酸化にはCK1εが関わることが報告されている（Lee., et al, EMBOJ, 2012）。従って、DapleによるDvl2（Thr224）のリン酸化がCK1ε阻害剤のIC261で抑制されるかどうか確認したところ、IC261によって当該リン酸化が抑制されたことを確認した（Fig.1B）。また、DapleとCK1εが結合することに加えて、GCVドメインはDapleとCK1εの結合に関与しないことを明らかにした（Fig.1C, D）。さらに、Dapleのノックダウン（KD）を行うことで、Dvl2とCK1εの結合が減少することも確認した（Fig.1E）。これらのことから、Dapleが異なるアミノ酸部位を介してCK1εとDvl2にそれぞれ結合し、CK1εを介したDvl2（Thr224）のリン酸化を亢進していることが示唆された。
次に、Dvl2のThr224の機能解析を行った。Dvl2のThr224をAlanineに置換した変異型Dvl2発現ベクターを作成し（Fig.2A）、次に当該発現ベクターをHEK293細胞株に遺伝子導入し、β-catenin活性を評価した。その結果、野生型Dvl2と比較して変異型Dvl2でβ-catenin活性が有意に減少したことから、Dvl2におけるThr224のリン酸化がβ-catenin活性に関わることがわかった（Fig.2B, C）。さらに、野生型Dapleが過剰発現したHEK293細胞株においてもβ-catenin活性が上昇することや（Fig.2D）、CK1ε阻害剤のIC261で当該β-catenin活性が抑制されることも明らかにした（Fig.2E）。これらのことから、Dapleが調節するDvl2(Thr224）のリン酸化はβ-catenin活性を促進することが示唆された。
最後に、Daple-CK1ε複合体が調節するDvl2(Thr224）のリン酸化の上流因子を決めることにした。上述の通り、Wnt3aはβ-catenin活性を促進する古典的Wntシグナル経路の最上流因子であり、Dvl2におけるThr224のリン酸化がβ-catenin活性を促進することから、Wnt3aに着目した。Daple KD HEK293細胞株と比較して野生型HEK293細胞株では、Wnt3a刺激によるDvl2におけるThr224のリン酸化とそれに続くβ-catenin活性が亢進されていることが分かった（Fig.3A, B）。また、Wnt3a刺激によってDapleが細胞膜にリクルートされDvl2との結合を増強することが確認された（Fig.3C, D）。以上から、Wnt3aが細胞膜上でのDapleとDvl2との結合と、CK1εによるDvl2(Thr224）のリン酸化によって、β-catenin活性が亢進することを明らかにした（Fig.4）。
【考察】
古典的Wntシグナル経路において、足場タンパク質が、CK1によるDvlのリン酸化反応を調節することは殆ど知られておらず、本研究が非常に興味深い知見を示した。今後の課題は、Wnt3a刺激がどのようなにDapleを細胞膜へリクルートするのか、その分子機構を明らかにすることである。
【結語】
本研究では、古典的Wntシグナル経路におけるDapleの機能を明らかにし、当該シグナル経路における新しい知見を見出した。
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