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ポリエンの合成を担うII型ポリケタイド合成酵素の機能解析

DU, DANYAO 東京大学 DOI:10.15083/0002002070

2021.10.04

概要

第一章 序論
 放線菌の二次代謝産物は高い構造多様性を有しており、その多様な構造に応じ様々な生理活性を持ち、医薬品資源として重要な位置を占めてきた。しかし、近年では新規な構造や有用な生理活性を示す化合物の発見が減少傾向にあり、新たな化合物を見出すための有力な手法が求められている。その一例として、細菌のゲノムにコードされているが、通常の実験室培養条件では発現しない休眠生合成遺伝子クラスターを活性化させる手法が挙げられる。本論文ではまず、新規な構造や有用な生理活性を有する化合物の取得を目指し、網羅的な転写活性化因子の強制発現による休眠生合成遺伝子クラスターの活性化を試みた。
 有名な放線菌二次代謝産物として、酢酸を基本単位とするポリケタイドが挙げられる。ポリケタイドの生合成研究はその生合成酵素が触媒する様々な化学反応を明らかにすると共に、人工設計による新規化合物の創出のための手段を提供できる。本研究の後半では休眠生合成遺伝子クラスターの活性化により見出された新規ポリケタイド化合物ishigamideの生合成研究を行った。Ishigamide生合成経路を明らかにし、その生合成を担う新規II型ポリケタイド合成酵素(PKS)の機能同定、触媒分子メカニズムの解明を目的とし、研究を進めた。

第二章 SARPファミリー転写活性化因子遺伝子の強制発現による休眠生合成遺伝子クラスターの活性化[1]
 本研究の研究対象である放線菌Streptomyces sp. MSC090213JE08(JE08株)のドラフトゲノム解析から、27個の推定休眠生合成遺伝子クラスターが見出された。そこで、転写活性化因子の強制発現および放線菌培養条件の検討により、これらの遺伝子クラスターを活性化し、その生産物を探索した。具体的には、Streptomyces antibiotic regulatory protein(SARP)ファミリー転写因子をJE08株のドラフトゲノムから探索し、計8つのSARP強制発現株を構築した。これらを4種類の培地で培養し、代謝プロファイルを調べた。その結果、特定の培養条件において、4つのSARP強制発現株から、計8つの未知化合物が見出された。この結果は網羅的なSARP強制発現と培地条件の検討の組合わせが休眠生合成遺伝子クラスターの活性化手法として有用であることを示している。これらの化合物のうち1つを単離、構造解析した結果、それが新規化合物、3-((2E,4E,6E,8E)13-hydroxytetradenca-2,4,6,8-tetraenamido)propanoic acid(ishigamide, Figure 1)であることが明らかになった。

第三章 Ishigamide生合成遺伝子クラスター(igaクラスター)の同定とin silico解析[1],[2]
 Ishigamide構造中の不飽和脂肪酸部位はPKSにより合成される可能性が高い。それを指標にJE08株のドラフトゲノムを探索したところ、3つのishigamide生合成遺伝子クラスター(igaクラスター)候補が見出された。各候補クラスターに存在するketosynthase(KS)遺伝子の破壊により、igaクラスターを同定した。予想外なことに、igaクラスター中の不飽和脂肪酸部位はII型PKS(IgaPKS)により生合成されることが強く示唆された。II型PKSは還元度の低い芳香族ポリケタイドの合成に特化したものと長年考えられていたため、IgaPKSが還元度の高いポリエン骨格を合成することは大変興味深い。Insilico解析より、IgaPKS中のIga11(KS)、Iga12(chain length factor, CLF)とIga13(ketoreductase, KR)は典型的なII型PKSのものとは異なるクレードに分類されることが明らかになった。そこで、IgaPKSをポリエン合成能を有する高還元型II型PKSの代表として提唱し、さらなる機能解析を行うことにした。

第四章 Ishigamideポリエン骨格生合成のin vitro再構成[2]
 大腸菌を宿主に用いて、ishigamideポリエン骨格の生合成に関与すると思われるIgaPKS酵素群をそれぞれ組換えタンパク質として調製し、それらの機能解析と速度論解析を行った。推定生合成経路(Figure1)を検証するのにあたり、まず修飾酵素であるIga13とIga16(dehydratase)の機能解析を行った。Iga10(acyl carrier protein, ACP)に結合した反応中間体を模倣するN-アセチルシステアミン(NAC)体を化学合成し、in vitro解析に供した。その結果、Iga13はNADPHを補酵素とし、3-oxooctanoyl-NAC(1)を(3R)-hydroxyoctanoyl-NAC(2R)に還元する活性を、Iga16は2Rとtrans-2-octenoyl-NAC(5)の相互変換を触媒する活性を示した。以上の結果から、Iga13とIga16は厳密な立体選択性を示し、ポリケタイド中間体の-ケト基をR体の水酸基、E体のオレフィンへと変換することが示された。次に、holo-Iga10を調製し、それがmalonyl-CoAに対し自己アシル化能を有することを確認した。Iga11とIga12は複合体としてのみ調製可能だった。Iga11-Iga12複合体はacyl-CoA由来のアシル基をIga11の活性Cysに転移させる活性を示した。また、Iga11-Iga12複合体をholo-Iga10、malonyl-CoA、hexanoyl-CoAと共に反応させたところ、3-oxooctanoyl-Iga10のみが生成した。このことから、既知のII型PKSのKS-CLFが連続的な縮合反応を触媒するのに対し、Iga11-Iga12複合体は単独では一回の縮合反応のみを触媒することが明らかになった。つまり、反応中間体の-ケト基がIga13、Iga16による修飾を受けて、オレフィンに変換されない限り、次の縮合反応は起こらないと考えられる。最後に、IgaPKS全体の触媒反応を調べるために、Iga11-Iga12複合体、holo-Iga10、Iga13、Iga16をmalonyl-CoA、hexanoyl-CoA、NADPHと共に反応させた。Iga10に結合しているポリケタイド鎖をアルカリ加水分解により切り離し、分析したところ、4つの不飽和カルボン酸(Figure1、7-10)の生成が確認された。この結果から、Iga11-Iga12、Iga13、Iga16がそれぞれ触媒する縮合、還元、脱水の反応サイクルによりポリエン骨格が伸長していることが明らかになった。また、IgaPKSは異なる長さのacyl-CoA(C2~C12)をスターター基質として取り込めること、また、この時、伸長回数はacyl-CoAの長さに応じて増減することがin vitro解析により明らかになった。以上の研究により、IgaPKSがポリエン骨格の生合成を担うことが証明された。これは、II型PKSは還元度の低い芳香族化合物だけを生合成するという従来の定説を覆すものであり、PKSに関する知見を広げた。

第五章IgaPKSのX線結晶構造解析
 IgaPKSが触媒するポリエン合成の分子機構を理解するため、IgaPKSのX線結晶構造解析を行い、Iga11-Iga12の構造を最高分解能1.75Åで、Iga10=Iga11-Iga12三者複合体の構造を最高分解能1.98Åで明らかにすることに成功した(Figure2)。この結果は、actinorhodin生合成経路由来のActKS-ActCLFに続くKS-CLF結晶構造の二例目であり、KS-CLFとACPが形成する三者複合体結晶構造の初めての例である。Iga10=Iga11-Iga12三者複合体の調製には4’-phosphopantetheinylアナログの先端にalkene chloride構造を付加したcrosslinkプローブを利用した。Iga11-Iga12は脂肪酸生合成由来のKSホモダイマーやActKS-ActCLFと類似した全体構造を示した。Iga11-Iga12の反応ポケットの入り口はIga11の表面にあり、その真下にKSの触媒三残基(Cys-His-His)が位置していた。このCysからIga12の方向に向けてポケットが伸展しており、その深さは約20Åであった。この反応ポケットのサイズはishigamideのポリケタイド鎖を収容するのに適切である。ActKS-ActCLFとは異なり、ポケットを構成するアミノ酸には極性のものが多いが、それらの側鎖はポケットの内側を向いておらず、ポケットは適度な疎水的環境を保持していた。また、Iga10のhelixII,IIIには酸性アミノ酸残基が多くあり、これらがIga11-Iga12の塩基性アミノ酸残基と水素結合を形成していた。水素結合を形成する塩基性アミノ酸残基のうち4つをそれぞれAlaに置換すると、いずれの場合もcrosslinkプローブを付加したIga10とIga11-Iga12間のcrosslink複合体形成効率が低下したため、これらの水素結合がIga10とIga11-Iga12間の相互作用に重要であることが示唆された。これらの結晶構造より、Iga11-Iga12とIga10によるポリエン骨格の鎖伸長に関する分子メカニズムが提唱できた。

第六章 Iga10とIga11-Iga12間の相互作用に関する研究
 上述したcrosslink複合体形成効率の計測とisothermal titration calorimetry(iTC)解析を利用し、Iga10とIga11-Iga12間の相互作用を調べた。その結果、IgaPKSシステムにおいては、Iga10phosphopantetheinyl基に結合している分子の化学構造(アシル鎖の長さ、ポリケタイド位の修飾)にかかわらず、Iga11-Iga12はIga10を認識し、それと相互作用できることが示唆された。iTC解析より、両者のKDは約10μMであると算出された。さらに、Iga11-Iga12は異なるII型FAS/PKSシステム由来のACPと相互作用でき、また、Iga10もII型FAS由来KSダイマーや異なるII型PKS由来のKS-CLFと相互作用できることがcrosslink実験により示された。

第七章 総括
 本研究は天然物創薬に向けた新規構造を有する化合物の探索及びその生合成機構の解明を目的とした。まず、休眠生合成遺伝子クラスターの活性化より、新規ポリケタイドishigamideを発見した。次に、その構造中のポリエン骨格の合成を担う新規な還元型II型PKSサブファミリーを提唱し、その触媒能をin vitro解析により明らかにした。さらに、X線結晶構造解析により、その触媒分子メカニズムを考察した。本研究より得られた知見は、新規有用化合物の創出に向けた酵素工学や合成経路の設計に有用であると考えられる。

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