Construction of genetically-engineered Escherichia coli for sustainable ammonia production

概要

代表的なアンモニア生産法であるハーバー・ボッシュ法は、原料となる水素の製造や窒素固定反応の進行に多量の石油や天然ガスを要するため、その持続可能性への懸念が広がっている。これに代わる、微生物を利用した環境負荷の低いアンモニア生産法の開発に近年注目が集まっている。例えば、微生物のアミノ酸異化能力によって未利用資源からアンモニアを生産する方法、窒素固定細菌の遺伝子を利用して、他の生物に窒素固定能力を付与する方法などが検討されている。しかし、これら生物機能を利用したアンモニア生産法には、生産効率に課題がある。

本研究では、持続可能なアンモニア生産法の確立と生産効率向上を目標に、窒素を豊富に含む食品副産物からの効率的なアンモニア生産法と、窒素固定細菌 Azotobacter vinelandii 由来の遺伝子群の異種発現による生物学的窒素固定法について検討した。

１．食品副産物からの効率的なアンモニア生産法の開発
未利用資源のうち、タンパク質を多く含むにも関わらず有効活用されていない食品副産物を原料とし、野生型大腸菌 Escherichia coli のアミノ酸異化反応を用いてアンモニアを効率的に生産する方法を検討した。まず食品副産物（しょうゆ粕、みりん粕、トマト粕、おから）をプロテアーゼとセルラーゼで処理してろ過した酵素処理食品副産物含有培地と、汎用培地（M9 改変培地、LB、YPD）に野生型 E. coli を添加し、アンモニアを生産させた。培養上清中のアンモニア量と各培地中のアミノ酸総量との相関を調べたが、これらの値に相関は見られず（R2=0.05）、アミノ酸からのアンモニアへの異化反応に影響を与える要因の存在が示唆された。次に、アンモニア生産量に影響を与える要因を同定するため、各培地中のアミノ酸、有機酸、糖などの親水性成分を定量し、アンモニア生産量と親水性成分量との関係を部分的最小二乗回帰（Partial Least Squares Regression: PLSR）により解析した。その結果を反映することで、培地中の親水性成分量からアンモニア生産量を精度よく予測することができた（R2=0.69）。各成分のアンモニア生産量への寄与度を調べたところ、プロリン、グルタミン、グルタミン酸、セリンはアンモニア生産量を上昇させること、グルコース、フルクトースがアンモニア生産量を低減させることが統計的に示唆され、実験によってグルコースによるアンモニア生産阻害効果を明らかにした。さらに、グルコースによるアンモニア生産阻害効果を回避するための遺伝子改変を行った。菌体内へのグルコース取込みとアンモニアの同化反応を抑えるため、グルコーストランスポーター遺伝子 ptsG とグルタミンシンテターゼ遺伝子 glnA を破壊した。おからの酵素分解物を含む培地において、各遺伝子の単独破壊株ではアンモニア生産効率がわずかに向上するにとどまったが、二重破壊株においてはアンモニア生産効率が大幅に向上し、35.4 mM のアンモニアが生産された（遊離アミノ酸全窒素 75.9 mM に対して収率 47％）。以上のように、グルコースが多量に存在する食品副産物を原料とする場合、E. coli の ptsG と glnA の二重破壊がアンモニア生産性の向上につながることを明らかにした。

２．A. vinelandii 由来のニトロゲナーゼ関連タンパク質を生産する組換え大腸菌の構築
A. vinelandii は酸素高感受性のニトロゲナーゼを生産するが、未知の機構により好気的な条件下でも窒素固定が可能である。A. vinelandii の nif (nitrogen fixation)関連遺伝子を異種発現させることは、好気条件下での生物学的窒素固定法を確立するための有望な戦略であると考えられる。まず、A. vinelandii のニトロゲナーゼを大腸菌で再構成するため、Overlap Extension PCR によって A. vinelandii ゲノムに散在する nif 関連遺伝子（nifHDKBUSVQENXYWZMF および iscA）とプロモーター配列とを融合した人工遺伝子クラスターを構築し、シームレスクローニングにて発現プラスミドに挿入し、これらのプラスミドを E. coli に導入した。E. coli 形質転換体の nif 関連遺伝子の発現を RT-qPCR により転写レベルで解析したところ、 IPTG 誘導により、17 種類の nif 関連遺伝子の転写レベルが 2.9～8.7 倍に上昇したことが示された。さらに、17 種類の nif 関連遺伝子の発現をタンパク質レベルで確認するため、E. coli 形質転換体からタンパク質を抽出し、そのトリプシン分解物を LC-MS/MS にて定量した。ニトロゲナーゼ MoFe タンパク質の α サブユニット（NifD）、β サブユニット（NifK）、MoFe タンパク質に電子を供給する Fe タンパク質（ NifH）、およびニトロゲナーゼの成熟に関与する NifS、NifV、NifB、 NifQ、NifU、NifE、NifN のタンパク質発現レベルは A. vinelandii に比べて有意に高いことが分かった。さらに、アセチレン還元法にて E. coli 形質転換体のニトロゲナーゼ活性を測定したところ、嫌気条件下で 4.96 nmol/mL のエチレンを生産し、これは A. vinelandii の生産量（5.69 nmol/mL）と同程度であった。一方、微好気条件下では 4.13 nmol/mL に減少し、同様の条件下での A. vinelandii の生産量（25.8 nmol/mL）よりも低い値であった。

３．A. vinelandii 由来ニトロゲナーゼ活性向上因子の探索
E. coli 形質転換体のニトロゲナーゼ活性向上に寄与する遺伝子を、A. vinelandiiから探索した。A. vinelandii は窒素源の有無や酸素濃度に応じて遺伝子転写プロファイルが大きく変動する。特に培地中に窒素源を含まない条件では、ニトロゲナーゼ関連遺伝子群の転写量が大きく上昇することが知られている。そこで、ニトロゲナーゼ関連遺伝子群と同様の転写変動を示す遺伝子群の中に、E. coli 形質転換体のニトロゲナーゼ活性を向上させる遺伝子が含まれることを想定して実験を進めた。まず、候補遺伝子同定のために、窒素源の有無と試験管ヘッドスペース酸素濃度（5、10、 20%）の 2 因子の組合せ、全 6 条件にて RNA-seq による比較トランスクリプトーム解析を行った。得られた各遺伝子のリード数を元に階層的クラスタリング解析を実施したところ、ニトロゲナーゼ関連遺伝子群と同様の転写変動を示すクラスターに213 種類の遺伝子が分類された。この遺伝子群の中から、nifH などすでに発現させている nif 関連遺伝子、ncRNA および rRNA を除き、一方でオペロンにて同時に転写される遺伝子を追加することで、合計 202 種類の遺伝子を大腸菌発現用プラスミドにクローニングした。このプラスミドをニトゲナーゼ発現 E. coli に導入し、ニトロゲナーゼ活性を測定した。微好気条件培養時において、ニトロゲナーゼ活性が2.4 倍以上に向上した形質転換体が 20 種類得られ、そのうち 12 種で糖代謝関連遺伝子が導入されていた。糖代謝関連遺伝子は細胞内の還元力を高めることでニトロゲナーゼ活性を向上させたのではないかと考え、E. coli 形質転換体の NAD+ および NADH を測定した。対照株（empty vector）では、NADH 濃度が低く NAD+ 濃度が高いため、非常に高い NAD+/NADH 値を示した。一方、ニトロゲナーゼ活性が向上した株では、NADH 濃度が上昇し、NAD+/NADH 値が低下した。以上の結果から、A. vinelandii より同定した、E. coli 形質転換体のニトロゲナーゼ活性向上遺伝子群は、細胞内の還元力を高めることでニトロゲナーゼ活性の向上に寄与していることが示唆された。

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