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SNARE protein Syntaxin 3 is involved in functional regulation of serotonin transporter

本池 芹佳 広島大学

2020.03.23

概要

【背景と目的】
セロトニントランスポーター(SERT)は、神経終末から放出されたセロトニン(5-HT)を神経終末に再取り込みすることにより、5-HIT神経伝達の終了を担う膜タンパク質である。SERTは翻訳された後に小胞体(ER)にて糖鎖修飾を受ける。その後、ゴルジ体を経由し、細胞膜へと運ばれる。以前の研究で、SERTのC 未端の膜輸送と糖鎖修飾に対する役割を明らかにするために、SERTのC末端欠損変異体(SERTACT)の特性を検討した。SERTACTは、折りたたみ不全タンパク質であり、膜輸送が阻害され ER に停留すること、およびER ストレスは、SERT の膜輸送を障害し SERTをERに停留させ、SERTACT と同様な状態を作ることが明らかになった。

SERT や SERTACT の膜輸送を促進する薬物は、SERT の機能修飾を介して 5-HT 神経伝達を変化させうる。また、このような薬物は、ER ストレス緩和作用を持つことも期待できる。我々は、SERTACT の取り込み活性を著明に改善させる薬物としてシグマ 1 受容体作用薬のSKF-10047を見出した。また、SKF-10047の24時間投与で変動する遺伝子として、膜輸送に重要な働きを持つ Syntaxin8(STX3)を同定した。そこで本研究では、SERT機能に及ぼす STX3の影響について検討した。

【結果】
① SERTに対する STX3 過剰発現の影響
Myc-DDK-STX3 cDNAと野生型 FLAG-SERT を、電気容法を用いて AD293 細胞(HEK293の亜型)および COS-7 細胞に遺伝子導入した。また、FLAG-SERT 安定発現 HEK293 細胞(FLAG-SERT HEK細胞)には Myc-DDK-STX3 cDNA を遺伝子導入した。遺伝子導入 48時間後に細胞1個当たりの蛍光 SERT 基質取り込み量を平均し、取り込み活性として測定した。その結果、一過性 FLAG-SERT 発現 AD293 細胞、COS-7 細胞では、STX3の過剰発現は、SERT取り込み活性を減少させた。

一方、western blotting による検討では、STX3の過剰発現により、SERT タンパク質の完全糖鎖修飾体が減少した。

Myc-DDK-STX3 と HA-SERT を COS-7 細胞に発現させて蛍光免疫染色にて観察すると、HA-SERT、Myc-DDK-STX3は、主に小胞体やゴルジ体で共局在し一部凝集体を形成することが確認された。また、STX3が過剰発現している細胞では SERT の膜発現が抑制された。

これらの結果から、過剰発現された STX3は SERT をゴルジ体や小胞体に留め，凝集して細胞膜発現を抑制する可能性があることが示唆された。

② SERTに対する STX3ノックダウンの影響
STX3 siRNA と野生型 SERT を、電気容法を用いて AD293 細胞および COS-7 細胞に遺伝子導入した。また、FLAG-SERT HEK細胞にはSTX3 siRNA を遣伝子導入した。遺伝子導入48時間後に取り込み活性を測定したところ STX3のノックダウンは、いずれの細胞でも影響を及ぼさなかった。

一方、western blotting では、STX3のノックダウンにより、SERT の完全修飾体のバンドが上方移動した。また、糖鎖切断酵素の検討から、この上方移動は糖鎖修飾の変化に起因するものであることが明らかとなった。

この結果から、STX3はSERTの糖鎖修飾に何らかの影響を与えることが示唆された。

③ 内在性にSERT と STX3 を発現するヒト大腸がん由来 Caco-2細胞における、SERT の局在および取り込み活性の検討
Caco-2 細胞の内在性 SERT および STX3の局在を免疫蛍光染色で観察したところ、SERT とSTX3は微絨毛マーカーの villin と共局在し、SERT と STX3の一部は微絨毛に局在することが明らかとなった。

STX3 siRNA を、電気穿孔法を用いて Caco-2細胞に遺伝子導入した。72時間後、単位タンパク質あたりの【H5-HTの取り込み量を、SERTの取り込み活性として測定した。その結果、Caco-2細胞では、STX3をノックダウンすると、SERT取り込み活性が抑制された。

これらの結果から、STX3はCaco-2細胞において共局在する SERT の機能を調整する可能性があることが示唆された。

【考察とまとめ】
以上の結果から、AD298 細胞とCOS-7細胞ではSERT と STX3は細胞内で共局在し、STX3はSPRTの糖鎖修飾に何らかの影響を与えることが考えられた。また、Caco-2細胞においても、STX3は共局在する SERTの取り込み活性を正に制御することが示唆された。本研究より、STX3はSERT の膜輸送の過程で SERT と共局在し、SERT の機能を調節する可能性が示唆された。

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