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Search of functional organic-inorganic hybrid molecules on vascular endothelial cell proliferation and analysis of mechanisms underlying the proliferation based on bioorganometallics research strategy

中村 武浩 Takehiro Nakamura 東京理科大学 DOI:info:doi/10.20604/00003641

2021.06.09

概要

本論文では,有機-無機ハイブリッド分子(以下,ハイブリッド分子)を生体機能解析に活用する新しい研究戦略バイオオルガノメタリクスに基づき,構築したハイブリッド分子ライブラリーより血管内皮細胞に対して細胞毒性を示さない亜鉛錯体Zn(II)2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (Zn-12)を見出し,それが内皮細胞増殖を強力に促進することを明らかにした。併せて,そのメカニズムが線維芽細胞増殖因子-2 (FGF-2)システムを介さないERK1/2のリン酸化促進を含むことを示した。

血管内皮細胞は血管内腔を層状に覆うことで血管壁を構成しており,血管平滑筋細胞と協奏的に働くことで,血液トーヌスや凝固線用系の調節,血管新生や恒常性の維持にも寄与している。これらの血管機能の一部は,必須微量元素の濃度や局在によって制御されているため,細胞内の金属バランスが崩れると血管の機能不全を引き起こす場合がある。また,血管は全身臓器にユビキタスに存在しているため,体内に侵入した活性化物質や毒物が血管を通過することなしに標的器官に到達することはできない。メチル水銀による脳溝周辺の障害など,血管細胞の機能的な障害が直接的に器官毒性につながる事例も存在している。そのため,血管内皮細胞の機能解析は,毒性学上,きわめて重要であるといえる。血管内皮細胞の増殖は血管内皮の修復や血管層の維持において最も重要な事象である。

血管内皮細胞の増殖を促進する細胞増殖因子としては,FGF-2が特に重要である。このうち,VEGFは微小血管の内皮細胞や周皮細胞から分泌され,微小血管内皮細胞増殖の促進を通じて内皮細胞層を維持する。一方,FGF-2は分子内にシグナル配列を持たないため分泌されず,傷害された内皮細胞から逸脱して近傍の内皮細胞の遊走と増殖を促して内皮細胞層の修復を促進する。内皮細胞層にはへパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種パールカンが多く存在するが,そのへパラン硫酸糖鎖はFGF-2のFGF受容体(FGFR)と三者複合体を形成することによってFGF-2の活性を増強するoFGF-2の増殖シグナルはMAPKによって介在される。現在まで,血管内皮細胞の増殖促進作用を有する低分子量化合物は発見されておらず,したがって低分子量化合物による増殖促進機構解析も行われていない。

バイオオルガノメタリクスとは,ハイブリッド分子を生体機能解析に活用する新しい研究戦略である。有機化合物である配位子と無機金属が組み合わされた錯体は,分子内相互作用によって既存の有機化合物あるいは金属イオン単独では成し得ない生物活性を発現する可能性がある。毒性学の視点から,バイオオルガノ メタリクス研究には2つのタイプの研究が存在する。第一は,ハイブリッド分子の毒性学である。毒性は化学物質の生物活性の1つであるため,金属錯体の毒性は,その分子を構成する配位子および金属イオン単独の毒性から予測できない。第二に,ハイブリッド分子の特異な生物活性から生体機能解析を行う研究である。実際に,この研究戦略によって内皮細胞機能の新しい制御機構が明らかにされている。

この観点から,まず構築したハイブリッド分子の毒性を評価した。すなわち,2,9-dimethyl-1,1 〇-phenanthroline (DMP)を基本骨格(配位子)として,亜鉛(Zn),マンガン(Mn),鉄(Fe),コバルト(Co),ニッケル(Ni),銅(Cu),カドミウム(Cd),水銀(H g ) , 鉛(P b ) から成る9 種のD M P 錯体を調製した。これらおよび構成部分であるDMPおよびそれぞれの無機金属イオンの血管内皮細胞に対する細胞毒性を評価したところ,Cu-DMPおいてきわめて強い細胞毒性が観察された。DMPおよび銅イオンはそれぞれ細胞毒性を示さなかったので,DMPおよび銅イオンは錯体を形成することによって相乗的な細胞毒性を示すことが明らかになった。この強い細胞毒性は,錯体形成による細胞内への高い蓄積に依存することが示唆された。併せて,この研究において,血管内皮細胞に対して細胞毒性を示さないZn-DMP (Zn-12)を見出した。

次に,無機亜鉛がFGF-2依存的に血管内皮細胞の増殖を促進することが報告されていることから,内皮細胞増殖を促進する亜鉛錯体を探索した。アミノ酸や多環構造を有する様々な配位子を有する亜鉛錯体ライブラリー(32種)を構築した。これを用いて内皮細胞に対する増殖促進活性を[3H]チミジンの取り込みを指標に評価したところ,Zn-12がきわめて強い活性を示すことを見出した。配位子DMPには増殖促進活性は認められず,また,Zn-12の活性は無機亜鉛よりも有意に高く,さらにZn-12の作用は亜鉛以外の8種の金属置換体(2 )(Mn-DMP, Fe-DMP, Co-DMP, Ni-DMP, Cu-DMP, Cd-DMP, Hg-DMP および Pb-DMP)に比べ顕著に強力であった。細胞内への蓄積を,細胞内亜鉛量を指標に調べたところ,Zn-12の蓄積性は無機亜鉛と同等であった。Zn-12は細胞内のFGF-2 mRNAレベルを上昇させたが,FG F-2タンパク質は増加せず,また,FG FR mRN AおよびFG FRタンパク質についてはいずれも増加は認められなかった。しかしながら,Zn-12はFGF-2の下流シグナルを介在するERK1/2のリン酸化を増加させていた。p-38 MAPKおよびJNKのリン酸化は増加しなかった。これらの結果から,Zn-12はFGF-2-FGFRを介さずにFGF-2-FGFRの下流にあるERK1/2を活性化することで内皮細胞増殖を促進することが明らかとなった。前述のように,へパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種パールカンはFGF-2システムの活性化に重要に関与している。そこで,血管内皮細胞のプロテオグリカン合成に対するZn-12の作用を調べたところ,Zn-12は細胞密度が高いときには[35S]硫酸のプロテオグリカンへの取り込みを増加させたが,細胞密度が低いときにはこれを減少させることが示された。このような作用は血管平滑筋細胞では観察されなかった。コアタンパク質を分析したところ,内皮細胞のプロテオグリカン合成に対するZn-12の細胞密度依存的な作用はパールカンに対する作用を反映していることが確認された。さらにこのZn-12の作用は配位子のDMPの作用によることが示唆された。このように,Zn-12が増殖の活発な低い細胞密度の内皮細胞においてパールカン合成を阻害するにも関わらず増殖を促進することは先に述べた「FGF-2-FGFRを介さずにFGF-2-FGFRの下流にあるERK1/2を活性化する」というZn-12の内皮細胞増殖促進機構を間接的に支持するものである。

本研究で得られた知見は,バイオオルガノメタリクスの研究戦略の有効性を示唆するものである。

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