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RNAを標的とした低分子創薬研究の基盤となるRNA-低分子間の相互作用解析 : RNA-低分子間のSAR探索アプローチ法の開発と検証

古園, 朋子 大阪大学 DOI:10.18910/82025

2021.03.24

概要

タンパク質に翻訳されない非翻訳RNAは,ゲノムから転写されたRNAの約80％を占め，スプライシングなどの遺伝子発現制御やタンパク質の合成などに深く関与している。このような背景からRNAは新規創薬ターゲットとして注目されており，近年RNAを標的とした低分子創薬研究についての報告例も増えている。しかしながら，RNAが取り得る立体構造の多様性やRNAに結合する低分子の例の少なさから，RNAを標的とする低分子の設計・選択指針は未成熟である。この課題を解決するために，RNA-低分子間の構造活性相関（structure-activity relationship，SAR）情報の解析が有効と考えられる。本研究では，RNAと低分子化合物のSARを網羅的に探索する研究手法を提案し，その有効性を検証した。本研究手法は，既に確立されているRNAモチーフの探索（in vitro selection法）と化合物スクリーニングを組み合わせ，それらを繰り返すことでRNA-低分子間のSAR情報を網羅的に収集することを狙っている（図1）。

第1章は，低分子化合物が結合するRNAモチーフの探索についての報告である。非翻訳RNAの一種であるmiRNAは，その前駆体であるprecursor-microRNA（pre-miRNA）がDicerにより切断されて産生される。一方先行研究により， pre-miRNAへの化合物結合がDicer切断反応を阻害することが分かっていた。そこで，化合物の標的RNAモチーフに対する結合親和性をDicer切断反応への阻害効果により評価するため，pre-miRNAのヘアピンループ領域にランダム配列を導入したpre-miRNAヘアピンループライブラリーを設計した。作製したRNAライブラリーを用いて，共同研究先である日本たばこ産業株式会社が所有する6化合物についてin vitro selection法を行った結果，化合物1に結合する配列R1-RNAが同定された（図2）。

第2章は，pre-miRNAのヘアピンループ変異体の作製についての報告である。先に同定された配列R1-RNAは，予期していたpre-miRNA様の二次構造を形成していなかった。そこでまず，配列R1-RNAの部分構造と化合物1との結合を表面プラズモン共鳴法（SPR）により評価し，化合物1の結合に必要な配列R1-RNA内の最小モチーフを探索・同定した。次に，その最小モチーフを内在性pre-miRNAであるpre-let-7f-2のヘアピンループ領域に導入したpre-miRNAのヘアピンループ変異体（pre-let-7f-2-loop-mt）を作製した（図2）。

第3章は，化合物スクリーニング及びpre-let-7f-2-loop-mtと化合物との相互作用解析についての報告である。 pre-let-7f-2-loop-mtに対して，化合物1の類縁体316化合物をSPRによりスクリーニングした。その結果，結合親和性がそれぞれ異なる4化合物が選抜された。これら4化合物について，pre-let-7f-2-loop-mtとの複合体モデルを作成した結果，ピロリジン環上の水素結合ドナーがアデニン42のリン酸酸素原子と水素結合を形成することが示唆された。複合体モデルを参考にSPRでpre-let-7f-2-loop-mtに結合を示さなかった他の類縁体と構造的特徴を比較した結果，この相互作用がpre-let-7f-2-loop-mtとの結合に関与していることが示唆された。一方で，これら4化合物は，pre-let-7f-2-loop-mtのDicerによる切断を阻害しなかった。今回得られた化合物は，親和性が低くDicer切断反応を阻害しなかった可能性や，溶解度の低さから適切な濃度で評価できなかった可能性が考えられた。

第1〜3章に報告した一連の研究により，任意の低分子化合物の結合標的RNAモチーフの取得，結合親和性の異なる複数の類縁体の取得，およびそれらのSAR解析が可能であることが実証された。

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