論文の公開元へ含硫アミノ酸と細胞死の関係 S-アデノシルメチオニン代謝による鉄依存性細胞死フェロトーシス誘導機構の解明
概要
博士論文
含硫アミノ酸と細胞死の関係
S-アデノシルメチオニン代謝による鉄依存性細胞死フェロトーシス誘導機構の解明
東北大学大学院医学系研究科医科学専攻
外科病態学講座小児外科学分野
多田 圭佑
目次
略語・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・3
Ⅰ. 要約・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5
Ⅱ. 研究背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・6
Ⅲ. 研究目的・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9
Ⅳ. 研究方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
Ⅴ. 研究結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・18
Ⅵ. 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・24
Ⅶ. 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・30
Ⅷ. 文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31
Ⅸ. 図説・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・38
Ⅹ. 表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・43
Ⅺ. 謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・44
Ⅻ. 図・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・45
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略語
APS
Ammonium Persulfate
Cleu
Cycloleucine
DFMO
Difluoromethyl ornithine
DMEM
Dulbecco's modified Eagle medium
DMSO
Dimethyl Sulfoxide
FBS
Fetal Bovine Serum
GSH
Glutathione
GNMT
Glycine N-methyltransferase
IFALD
Intestinal Failure Associated Liver Disease
MAT
Methionine Adenosyltransferase
Mat1/3
Methionine Adenosyltransferase 1/3
Mat2a
Methionine Adenosyltransferase 2A
Mat2b
Methionine Adenosyltransferase 2B
MT
Methyltransferase
NAFLD
Nonalcoholic fatty liver disease
NASH
Nonalcoholic steatohepatitis
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
3
Put
Putrescine
PVDF
PolyVinylidene DiFluoride
qPCR
Quantitative PCR
ROS
Reactive oxygen species
SAH
S-adenosylhomocysteine
SAM
S-adenosylmethionine
SAMDC
S-adenosylmethionine decarboxylase
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
SDS - Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis
SLC7A11
Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter,
y+ system), member 11
Spd
Spermidine
Spm
Spermine
TEMED
Tetramethylethylenediamine
T-TBS
Tris Buffered Saline with Tween 20
WT
Wild type
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Ⅰ. 要約
代謝活動は、生体代謝の中心臓器である肝臓の応答と、疾患プロセスに影響を与える
ことが知られている。IFALD や肝細胞癌などの肝疾患は、栄養成分の影響を受けるこ
とが知られているが、その背後にあるメカニズムは不明のままである。本研究では、含
硫アミノ酸の濃度と肝細胞応答の関係を調べることを目的とし、さらに SAM を合成し
てメチオニン代謝の中心的な役割を果たしている MAT に着目してその機序を調べた。
マウス肝癌細胞株である Hepa-1 細胞では、シスチン制限は顕著な細胞死を誘発した
が、シスチンとメチオニンの同時制限は細胞死を完全に抑制した。シスチン制限による
細胞死は、フェロトーシス阻害剤 Fer-1 で効率的に抑制され、このプロセスにフェロ
トーシスが関与していることが示された。シスチン制限による細胞死は、MAT2A のノ
ックダウンまたは MAT 阻害剤シクロロイシン添加による処理でも抑制された。さら
に、ポリアミン生合成経路のいくつかの酵素の阻害剤も細胞死を抑制した。Hepa-1 細
胞とは対照的に、初代培養マウス肝細胞はシスチン制限による細胞死を示さなかった。
これらの結果は、増殖能の高い肝癌細胞においてシスチン制限がフェロトーシスを誘
導する機構として、SAM-ポリアミン代謝が重要であることを示唆している。シスチン
制限は肝細胞癌の治療に有用である可能性があり、メチオニン制限は肝臓のフェロト
ーシスを治療標的とする場合に細胞死保護効果を示すと考えられた。
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Ⅱ. 研究背景
肝臓は生体における代謝の中心臓器だが、代謝活動自体が肝臓の機能や疾患プロセ
スに影響を与えることが知られている。例えば、非アルコール性肝疾患(Nonalcoholic
fatty liver disease; NAFLD)では、過剰な脂質摂取によって肝細胞内蓄積した脂質がク
ッパー細胞の活性化を介して肝組織に炎症をもたらし、肝繊維化などの反応を惹起す
ることで肝疾患の発症・進展に寄与する[1]。このように肝疾患と代謝活動には密接な関
わりがあるが、そのような疾患の一つとして、腸管不全関連肝疾患（Intestinal failure
associated liver disease; IFALD）と呼ばれる重篤な肝疾患がある[2]。これは大量腸切
除などを契機として、生存及び成長に必要な水分・栄養を十分に吸収できない重篤な腸
管機能不全を背景として、長期間の経静脈栄養が必要になる患者で認められる肝疾患
である。一度発症すると短期間のうちに肝硬変へ進行することがしばしば認められ[3]、
その発症及び進行のコントロールが非常に重要である。IFALD の病因としては、糖質、
脂質、アミノ酸などの経静脈栄養成分やその投与方法、静脈栄養カテーテルを介した細
菌感染や腸上皮バリア機能の低下によるバクテリアルトランスロケーションによる感
染症などさまざまな因子が指摘されている[4]。栄養素の配分や投与方法、感染管理の向
上により IFALD のコントロールは改善してきているものの、その克服には至っていな
い現状である。中でもアミノ酸に関わる検討は、Moss らが過剰なメチオニンが胆汁鬱
滞を引き起こす可能性を指摘している[5]が、過剰なアミノ酸と肝障害との関係を示唆す
る報告は少なく、詳細なメカニズムは不明なままである。
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一方で、メチオニンを制限することが全身の代謝活動の改善や、寿命延長効果をもた
らすことも報告されている。Lees らはメチオニン制限が肝細胞をはじめとして全身の
細胞における糖代謝や脂質代謝を改善することを報告している[6]。小幡らはショウジョ
ウバエモデルを用いて、メチオニン制限食の寿命延長効果には S-アデノシルメチオニ
ン (S-adenosylmethionine; SAM) の異化促進が寄与すること、すなわち、SAM 量低
下が寿命延長効果を引き起こすことを示した[7]。さらにメチオニン制限は肝臓癌を含む
幅広い癌種の治療応用で議論されており、動物モデルではメチオニン摂取を制限する
ことで癌の進展を防ぐ一定の効果があると報告されてきた[8-11]。一方、Xu らは、肝細
胞の同一性の維持と肝機能の発現に重要な転写因子であり、核内受容体ファミリーの
メンバーである HNF4α に注目し、肝癌細胞株で HNF4α をノックダウンすることで
メチオニン制限による細胞死が回避されることを報告した[12]。肝細胞とアミノ酸の関
係については、細胞外アミノ酸の濃度が肝細胞の成熟度を決定するという報告[13]や、
細胞外アミノ酸の欠乏が肝細胞を静止状態に誘導するという報告[14]がある。このよう
に、アミノ酸の変動により誘発される代謝変化は、肝臓の機能や肝癌細胞の増殖などに
大きな影響を与えることが確立しつつある。しかし、アミノ酸が肝臓の細胞応答とどの
ような機序で関連しているかについてはいまだに不明な点が多い。
メ チ オ ニ ン ア デ ノ シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (Methionine adenosyltransferase;
MAT)は、メチオニン代謝の中心的な酵素であり、メチオニンと ATP から SAM を合
成する[15]。MAT は Mat1a、Mat2a 及び Mat2b の 3 つの遺伝子にコードされており、
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その複合体形式により MAT1A の 4 量体である MAT1 と 2 量体である MAT3、MAT2A
とその制御因子である MAT2B からなる MAT2 として存在する[16, 17]。MAT1,3 は成熟
肝臓に発現しており、MAT2 は胎児肝臓、全身組織および肝細胞癌などの癌細胞で発
現している[15, 18, 19]。SAM は主要な細胞内メチル基供与体であり、メチルトランスフ
ェラーゼを介した DNA、RNA、およびヒストンのメチル化に使用され、遺伝子発現の
変化をもたらす[20, 21]。ヒストンに加えて、転写因子、リボソームタンパク質、翻訳因
子などの非ヒストンタンパク質もメチル化されてそれらの活性を調節する[22]。さらに、
脂質と炭水化物のメチル化でも SAM がメチル基供与体となる。様々な臓器や細胞の中
で、トランスメチル化反応が最も活発に行われるのは肝臓であることが知られている
[23]。SAM
が関与する代謝経路はメチル化に留まらず、メチオニンの再合成、システイ
ンの生合成、そしてポリアミン生合成系にも利用される[24]。システインはグルタミン
酸、グリシンと共に酸化ストレスに対する重要な還元物質の一つであるグルタチオン
の生成に利用される[24]。したがって、メチオニン−SAM 代謝系の変動は広範な代謝や
細胞機能の変化へとつながる可能性がある。
含硫アミノ酸であるシステインやメチオニンの変化が下流代謝系の変動を介して肝
細胞の機能や運命を変化させる可能性を考慮し、癌細胞モデルとしてマウス肝癌由来
の Hepa-1 細胞と、正常細胞モデルとして初代培養マウス肝細胞を使用して、これらの
アミノ酸制限の影響を調査した。また、その機序に MAT が関わるかどうかを検討し
た。
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Ⅲ. 研究目的
含硫アミノ酸であるメチオニン及びシステインの濃度変化が肝細胞障害に関わるの
かどうかを検証し、その機序を MAT の発現や SAM の代謝を基に解明する。
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Ⅳ. 研究方法
1. マウス
1）
マウス
C57BL/6J 系統の遺伝的背景を持つ、野生型マウス（Wild type ; WT マウス）は、
東北大学大学院医学系研究科附属動物実験施設で実施した他の研究における交配で得
られた野性型マウスを用いた。すべての動物実験は東北大学によって認可された動物
実験計画に基づき行われた（2019 医動-248）。動物実験に際しては東北大学における
動物実験等に関する規定を遵守し、愛護的に取り扱いを行った。
2）初代培養マウス肝細胞抽出
以前に報告された方法に従って手技を行った[25]。概要は以下の通りである。イソフ
ルランで麻酔後、腹部を切開し門脈を同定した。門脈にカニュレーションし下大静脈を
切離後、Liver perfusion medium（Thermo Fisher Scientific）で還流を 10 分間行っ
た。引き続き 0.05 %コラゲナーゼを含む HEPES buffer でさらに 10 分間還流した後
に、肝組織を摘出した。DMEM に肝細胞を懸濁し、70 µm のナイロンメッシュに通し
た後、Percoll を用いた濃度勾配法で遠心分離し肝細胞を精製した。Trypan blue で死
細胞を染色し、光学顕微鏡（Leica DMI 3000B）で生細胞数をカウントし生細胞割合
を算出した。
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3. 細胞培養
マウスの肝癌細胞株である Hepa1c1c7（Hepa-1）は、10% Fetal Bovine Serum (FBS)、
100 U/ml のペニシリン、0.1 mg/ml のストレプトマイシンを添加した Dulbecco’s
modified Eagle medium (DMEM, Gibco)を通常培地として用いて培養した。メチオニ
ン・シスチン調製培地は、10% Dialyzed FBS（Gibco、26500-036）、100 U/ml のペニ
シリン、0.1 mg/ml のストレプトマイシン及び 4 mM のグルタミン (Gibco)を添加した
グルタミン、メチオニン及びシスチンフリーの DMEM (Gibco、21013024）をベース
とし、L-メチオニン（Sigma）、L-シスチン（Sigma）をそれぞれ 10 µM または 200 µM
となるように調製した。メチオニン及びシスチンが 200 µM の培地を Normal mediun
(NM)とし、メチオニンのみを 10 µM に制限した培地を Methionine restriction (MR)、
シスチンのみを 10 µM に制限した培地を Cystine restriction (CR)、メチオニン及びシ
スチンを 10 µM に制限した培地を Methionine Cystine restriction (MCR)とした（表
2）。各細胞は 20,000 個/well (24well plate)もしくは 10,000 個/well (48well plate)で撒
かれ、NM で前培養を 24 時間行ったのちに各調整培地に培養液を交換し、さらに 24
時間培養を続けたのちにタンパク質抽出や RNA 抽出を行い、48 時間後に細胞死の定
量を行った（図 1A）。Hepa-1 細胞は解毒・代謝酵素の発現が他の肝癌細胞株と比較し
て高く[26]、肝細胞の代用として細胞実験に使用した。
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4. 顕微鏡観察
培養細胞は光学顕微鏡（Leica DMI 3000B）にて観察および撮影を行い、死細胞は、
0.5% トリパンブルー（和光純薬工業株式会社）で染色した。細胞数は TC20TM
Automated Cell Counter（Bio-Rad）または光学顕微鏡 (Leica DMI 3000B)で測定し
た。
5. フローサイトメーターによる細胞死判定
細胞死判定は以前に報告された方法と同様に、細胞死判定のマーカーである
Propidium iodide (PI) と Annexin V を用いて行った[27]。Hepa-1 細胞株または初代
培養マウス肝細胞を回収し、遠心後上清を取り除いてペレット化し、1×Annexin
binding Buffer (BD PharmingenTM
V (BD PharmingenTM
556454) で細胞を懸濁した。APC 標識 Annexin
556454)を 100 µl の Buffer あたり 3 µl 添加し、同時に PI を
終濃度 1 µg/ml となるように加え、暗室で室温に 5 分静置し反応させた。その後、細
胞懸濁液を 1×Annexin V binding buffer で 5 倍にメスアップし、フローサイトメー
ター (BD FACSAriaTM II ) で解析した。PI もしくは AnnexinV のいずれかもしくは
両方に陽性となる細胞を死細胞と判定した。
6. タンパク質抽出
熱処理以外の行程は氷上で行った。Hepa-1 及び初代肝細胞からのタンパク質抽出は、
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ディッシュの培地を吸引し、PBS で 2 回洗浄した後に、細胞体積の 2 倍量と推定され
る RIPA buffer（50mM Tris-HCl pH7.4、1 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
150 mM 塩化ナトリウム（NaCl）、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、
0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate ; SDS））を加え、10 分間、
4℃で激しく振盪混和した。その後 4℃、15000 回転/分で遠心分離を 10 分行い、上清
を回収した。回収した上清の 1/4 量の 5×SDS sample buffer（ 312.5 mM Tris-HCl
(pH = 6.8)、25% (v/v) 2-メルカプトエタノール、10% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム
(Sodium dodecyl sulfate ; SDS)、50% (w/v) グリセロール、0.01% (w/v) BPB）を加
え、5 分間沸騰加熱することで熱変性処理を行い、これを氷上で急冷したものを全タン
パク質抽出液とした。
7. SDS-PAGE (SDS - Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
全タンパク質抽出液を 10%ポリアクリルアミドゲル （Lower gel : 10%アクリルア
ミド、93.75 mM Tris-HCl (pH 8.8)、0.1% SDS、0.035% Ammonium Persulfate (APS)、
0.07% Tetramethylethylenediamine (TEMED)、Upper gel : 31.25 mM Tris-HCl (pH
6.8)、0.1% SDS、0.05% APS、0.1% TEMED）により電気泳動し、分子量に応じて展
開した。分子量の推定には ExelBandTM 3 色スタンダード (SMOBIO PM2500) とブ
ルースタンダード (SMOBIO PM1700) を用いた。
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8. ウェスタンブロット法
SDS-PAGE 後、ウェット法を使い 4℃で、350 mA、2 時間通電しポリフッ化ビニリ
デン膜 (PolyVinylidene DiFluoride ; PVDF 膜) (Millipore IPVH00010) に転写した。
転写後の PVDF 膜は 3%スキムミルク (和光純薬) が含まれる T-TBS (Tris Buffered
Saline with Tween 20) 中で、室温で 60 分間振盪することにより、ブロッキングした。
ブロッキング後、一次抗体として 3%スキムミルクを含む T-TBS で
希釈した下記の抗体を PVDF 膜に 4ºC で一晩反応させた。
抗 Actin 抗体 (Abcam ab3280)
1:4000
抗 Mat2a 抗体 ウサギ血清より精製[20]
1:4000
抗 Mat2b 抗体 ウサギ血清より精製[20]
1:1000
抗 Mat1/3 抗体 (Santa Cruz Biotech sc-28029)
1:4000
PVDF 膜を T-TBS で 3 回洗浄した後、2 次抗体として、Rabbit IgG HRP Linked
Whole Ab (GE healthcare NA934) 、 Mouse IgG HRP Linked Whole Ab (GE
healthcare NA931) のいずれかを用いて、1%スキムミルクを含む T-TBS で 1:500 も
しくは 1:1000 に希釈して PVDF 膜と室温で 1 時間反応させた。T-TBS で 3 回洗浄し
た後、PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific
32132)を用いて化学反応させ、ChemiDocTM MP Imaging System（Bio-Rad）を使用
してバンドを検出した。
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9. RNA 抽出および cDNA 合成
RNeasy Plus Mini Kit® (Qiagen 74136)を使用し、添付のプロトコールに従い、
Hepa1 細胞株または初代肝細胞より RNA の全抽出を行った。抽出した RNA の濃度を
吸光度計 (Thermo Fisher Scientific Nano Drop 1000 Spectrophotometer) を用い
て測定後、100~1,000 ng の RNA から、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase®
(Thermo Fisher Scientific 18080) 、 Random Primers (Thermo Fisher Scientific
48190011) を用いて逆転写反応を行った。cDNA (complementary DNA) は使用する
まで -30℃で凍結保存した。
10. 定量リアルタイム PCR
定量リアルタイム PCR (Quantitative PCR ; qPCR) は SYBR Green I によるイン
ターカレーター法で行った。cDNA を FastStart Essential DNA Green Master®
(Roche 06924204001) と遺伝子特異的なプライマーを混合し、LightCycler® Nano
(Roche) もしくは LightCycler® 96 (Roche) で反応および測定を行った。内在性コン
トロール遺伝子として、Actb を用い、内在性コントロールに対する相対値を算出して
比較した。各遺伝子のプライマー配列は表 1 に示した。
11. RNA 干渉
Mat2a を標的とする siRNA (Thermo Fisher Scientific Stealth RNAiTM siRNA )
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を用いて、Hepa-1 におけるこの遺伝子をノックダウンした。Lipofectamine RNAiMAX
transfection reagent（Invitrogen）を用い、プロトコールに従い、siRNA の導入を行
った。対照として、Stealth RNAiTM siRNA negative control medium GC (Thermo
Fisher Scientific 12935-300) を用いた。本実験に使用した siRNA 配列は下記の通り
である。
siMat2a #911
5'-AGGAAAGGATTATACCAAAGTGGAC-3'
12. ...
この論文で使われている画像
