Brassica rapaにおける病害抵抗性の分子機構

概要

Kobe University Repository : Kernel
PDF issue: 2024-05-02

Molecular mechanism underlying disease
resistance in Brassica rapa

AKTER MST ARJINA
(Degree)
博士（農学）

(Date of Degree)
2023-09-25

(Resource Type)
doctoral thesis

(Report Number)
甲第8746号

(URL)
https://hdl.handle.net/20.500.14094/0100485930
※ 当コンテンツは神戸大学の学術成果です。無断複製・不正使用等を禁じます。著作権法で認められている範囲内で、適切にご利用ください。

別紙様式 3 （博士論文審査等内規第 2条関係）

博士論文内容の要旨

名

氏

専攻・講座

AKTERMSTAR
JINA
BIORESOURCESCIENCE• PLANTSCIENCE

論文題目（外国語の場合は，その和訳を併記すること。）

M
o
l
e
c
u
l
a
rmechan
i
smu
n
d
e
r
l

(
B
r
a
s
s
i
c
a
r
a
E
aにおける病害抵抗性の分子機構）

指導教員

R ~ i mo t o

a

（氏名： AKTERMSTAR
J
INA NO.0
1
)

Abs
t
rac
t
B
r
a
s
si
c
ar
a
pai
sa
neconom
i
c
a
l
l
yi
mpo
r
t
a
n
tv
e
g
e
t
a
b
l
ec
r
o
pt
ha
tc
o
n
s
t
i
t
u
t
e
sf
o
u
rv
e
g
e
t
a
b
l
e
sn
a
m
e
l
y
Ch
i
n
e
s
ec
a
b
b
a
g
e
,t
u
r
n
i
p
,koma
t
s
u
n
a
,a
n
dpa
k
c
h
o
,
ia
n
di
sa
l
s
ou
s
e
da
so
i
l
s
e
e
d
s
,c
o
n
d
i
men
t
s
,a
n
d

f
o
d
d
e
rc
r
o
ps
.I
n
c
i
d
e
n
c
eo
fFusa
r
i
umy
e
l
l
o
w
sa
n
dwh
i
t
er
u
s
tc
a
u
s
e
dbys
o
i
l
b
o
r
n
ehemi
bi
ot
r
o
phi
c

pat
ho
ge
nFusar
i
umo
x
y
s
porumf
.s
p
.r
a
pae(
F
o
r
)o
rF
.o
x
y
s
porumf
.s
p
.c
o
n
gl
ut
i
n
a
n
s(
F
o
e
)
,a
n
d
bi
o
t
r
o
p
hi
coom
yc
e
t
epa
t
hog
e
nAlbu
gocand
i
d
ar
e
s
pe
c
t
i
v
e
l
yt
ha
ta
d
v
e
r
s
e
l
ya
f
f
e
c
tp
r
o
d
u
c
t
i
o
n
,a
n
d
c
a
u
s
es
u
b
s
t
a
n
t
i
a
ly
i
e
l
dl
o
s
s
e
si
nB
.r
a
pagl
o
b
a
l
l
y
.Asconven
t
i
o
n
a
ld
i
s
e
a
s
emana
g
emen
tt
e
c
h
n
i
q
u
e
s
a
r
et
i
me-consum
i
ng
,l
a
b
o
r
io
u
s
,a
n
dh
a
z
a
r
d
o
u
st
ot
h
ee
n
v
i
ronmen
t
,d
i
s
e
a
s
e
r
e
si
s
t
a
n
tc
u
l
t
i
v
a
r
sa
r
ea
n
e
x
c
e
l
l
e
n
to
p
t
i
onf
o
rt
hed
u
r
a
b
l
emana
g
emen
tofd
i
s
e
a
s
e
s
.Ar
e
s
i
s
t
a
n
tg
e
n
ea
g
a
i
n
s
tFo
c(F
o
c
B
r
1
)h
a
s
b
e
e
ni
d
e
n
t
i
f
i
e
dbu
tnota
g
a
i
n
s
tFori
nB
.r
a
pa
.QT
L
s
e
qu
s
i
ngf
o
u
rF
2p
o
p
u
l
a
t
io
n
sd
e
r
i
v
e
df
r
omFor
s
u
s
c
e
p
t
i
b
l
ea
n
dr
e
si
s
t
a
n
tl
i
n
e
sshowedo
n
ec
a
u
s
a
t
i
v
el
o
c
u
sonchromosomeA
0
3
,wh
i
c
hc
o
v
e
r
s
F
o
c
B
r
l
.Ex
p
r
e
s
si
ona
n
a
l
ys
i
sf
oundnod
i
f
f
e
r
e
n
c
ei
ne
x
p
r
e
s
si
onl
e
v
e
l
sofFocBrlbe
tw
e
e
nr
e
s
i
s
t
a
n
t
ands
u
s
c
e
p
t
i
b
l
el
i
n
e
s
.I
nc
o
n
t
r
a
s
t
,acom
pa
r
is
o
no
ft
heam
i
noa
ci
ds
eq
u
e
n
c
eo
fFocBrlbet
w
e
e
n
s
u
s
c
e
p
t
i
b
l
ea
n
dr
e
s
i
s
t
a
n
ta
l
l
e
l
e
sr
e
v
e
a
l
e
dt
ha
ts
i
xam
i
noa
ci
dd
i
f
f
e
r
e
n
c
e
sweres
pe
c
i
f
i
ct
os
u
s
c
e
p
t
i
b
l
e
l
i
n
e
s
.T
h
e
s
er
e
s
u
l
t
si
nd
i
c
a
t
et
ha
tFocBr
1i
si
mp
o
r
t
a
n
tf
o
rForr
e
si
s
t
a
n
c
e
,a
n
dc
h
a
n
g
e
dam
i
noa
c
i
d
s
e
q
u
e
n
c
e
sr
e
s
u
l
ti
nl
o
s
so
ff
u
n
ct
ionands
u
s
c
e
p
t
i
bi
l
i
t
y
.t
oFor(
f
o
c
b
r
1
2
)
.A newDNAm
a
r
k
e
r

(
f
o
c
b
r
l
2
m
) was d
e
v
e
l
o
pe
df
o
rt
he d
e
t
e
c
t
ion oft
h
ef
o
c
b
r
1
2 wh
i
c
hc
a
nd
i
f
f
e
r
e
n
t
i
a
t
et
h
e
he
t
e
r
o巧g
o
si
t
yofr
e
si
s
t
a
n
t(F
ocBr
1
)a
n
ds
u
s
c
e
p
t
i
b
l
e(
f
o
c
b
r
1
2
)a
l
l
e
l
e
s
. Lon
gnoncod
i
ngRN
As

(
l
ncRNAs)a
r
ef
r
a
gme
n
t
so
fRNAwi
t
hou
tp
r
ot
e
i
nt
ha
tpl
a
yi
mp
o
r
t
a
n
tr
o
l
e
si
ns
t
r
e
s
sr
e
s
po
n
s
e
s
(
a
bi
o
t
icandbi
o
t
i
c
)
. Thet
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
n
a
lr
e
l
a
t
i
o
n
s
h
i
pbe
tw
e
e
nmRNAs a
n
dt
h
e
i
rpa
i
r
e
dna
t
u
r
a
l
a
n
t
is
e
n
s
et
r
a
n
s
c
r
i
p
t
s(
N
A
T
s
)f
o
l
l
o
w
i
ngFoei
n
o
c
u
l
a
t
ionshowedapo
s
i
t
i
v
ea
s
s
o
ci
a
t
ionofe
x
p
r
e
s
si
on
l
e
v
e
l
sbe
tw
e
e
nt
h
e
m
.S
e
v
e
r
a
ld
e
f
e
n
s
e
r
e
s
po
n
s
e
r
e
l
a
t
e
dg
e
n
e
sa
n
dt
h
e
i
rNATpa
i
r
sa
r
er
e
s
po
n
si
b
l
ef
o
r

t
hi
sa
s
s
o
ci
a
t
ions
u
g
g
e
s
t
i
ngt
ha
tt
hec
o
o
r
d
i
na
t
ee
x
p
r
e
s
si
ono
fmRNAsandpa
i
r
e
dNATsp
l
a
ysar
o
l
ei
n
t
hed
e
f
e
n
s
er
e
s
po
n
s
ea
g
a
i
n
s
tF
o
e
.TheP
l
a
n
thormones
a
l
i
c
y
l
i
ca
c
i
d(
S
A
)a
l
s
or
e
s
i
s
t
sp
a
t
hog
e
n
i
c
a
ta
c
k
svi
ah
o
r
m
o
n
e
s
i
g
n
a
l
i
ngp
a
t
hwa
ysa
pa
r
tf
r
omr
e
s
i
s
t
a
n
c
eg
e
n
e
s
. Bype
r
f
orm
i
ngt
r
a
n
s
c
r
i
p
t
ome
a
n
a
l
ys
i
swi
t
ha
n
dwi
t
hou
tSAt
r
e
a
tm
e
n
ti
nt
w
okoma
t
s
u
n
ac
u
l
t
i
v
a
r
s(
B
r
a
s
si
c
ar
a
pav
a
r
.pe
r
v
i
r
i
di
s
)
,B
.
r
a
pa SA-i
n
d
u
c
e
dg
e
n
e
s(
B
r
S
A
I
G
s
)a
n
dB
.r
a
pa SA-su
pp
r
e
s
s
e
dg
e
n
e
s(
B
r
S
A
S
G
s
)
,r
e
s
pe
c
t
i
v
e
l
y

i
d
e
n
t
i
f
i
eda
tt
hewholeg
enomel
e
v
e
.
lGeneso
v
e
r
l
a
p
p
i
n
gbe
tw
e
e
nBrSAIGs
/Br
SASGsa
n
dp
a
i
r
e
d
ge
n
e
so
v
e
r
l
a
p
p
i
ngNATso
ri
nt
r
on
i
cn
o
n
c
o
d
i
ngRNAs(
i
ncRNAs)i
nt
he
i
re
n
c
o
d
i
ngr
e
g
i
o
n
si
n
c
l
u
d
i
n
g
3
3mRN
A/N
ATp
a
i
r
sa
n
dt
h
r
e
emRN
A
/
i
ncRNAp
a
i
r
sw
e
r
ei
d
e
n
t
i
f
ie
d
.F
o
l
l
o
w
i
ngSAt
r
e
a
tme
n
,
tt
h
e

t
r
a
n
s
c
r
i
p
t
io
n
a
lr
e
l
a
t
i
o
n
s
h
・
p
i betw
e
e
nmRNAsa
n
dt
h
e
i
rp
a
i
r
e
dNATswasa
l
s
oexam
i
n
e
d
,a
n
dt
w
oo
f
o
u
rpa
i
r
sshowedapo
si
t
i
v
ea
s
s
o
c
i
a
t
i
ono
fe
x
p
r
e
s
si
onl
e
v
e
l
sbe
tw
e
e
nmRNAsa
n
dt
he
i
rpa
i
r
e
dNATs.
f
T
h
e
s
er
e
s
u
l
t
ss
u
g
g
e
stt
ha
tnoto
n
l
ypa
t
hog
e
ni
n
o
c
u
l
a
t
ionbu
ta
l
s
oSAt
r
e
a
tme
n
tf
o
undt
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
n
a
l
c
o
o
r
d
i
na
t
ionbe
tw
e
e
nmRNAsa
n
dpa
i
r
e
dNATsa
n
dt
hi
sa
s
s
o
c
i
a
t
ionpl
a
ysar
o
l
ei
nSAr
e
s
po
n
s
e
.

（氏名： AKTER MST ARJINA N0.02)
Previously, SA treatment in the solid medium limited the number of samples that can be assayed
simultaneously. Alternatively, SA treatment by spraying on the samples revealed the upregulation of
all six genes that were shown to be upregulated following SA treatments on the medium found
following spraying. Transcriptional induction was also faster with SA spraying than by adding SA
into the MS medium indicating that SA spraying is more high- throughput and is applicable for
further experiments.
Differentially expressed genes (DEGs) between A. candida inoculated [48 and 72h after inoculation
(HAI)] and non-inoculated samples in resistant and susceptible cultivars of komatsuna were
identified using RNA sequencing. Notably, functional DEGs differed between the resistant and
susceptible cultivars in A. candida inoculated samples. Gene ontology analysis of DEGs following A.
candida inoculation in the resistant cultivar revealed that defense response-rela�ed terms were
overrepresented. SA-responsive genes tended to be changed in their expression levels by A. candida
inoculation in both resistant and susceptible cultivars, but different genes were identified between
the two cultivars. Genes involved in SA-dependent systemic acquired resistance (SAR) were
upregulated following A. candida inoculation in the resistant cultivar, but not in the susceptible
cultivar. Additionally, particular genes categorized as SAR that changed expression levels
overlapped between A. candida and Foe inoculated samples in resistant cultivars. These results
suggest a role for SAR in the defense response to both pathogens particularly in the
effector-triggered immunity (ETI) downstream pathway that will be useful for identifying pathways
or genes associated with the defense response to A. candida. Overall, my dissertation provides
significant insights into the disease resistance mechanism of Fusarium yellows and white rust
disease in B. rapa.

（別紙１）

論文審査の結果の要旨
AKTER MST ARJINA

氏名
論文
題目

審
査
委
員

Molecular mechanism underlying disease resistance in Brassica rapa
Brassica rapa における病害抵抗性の分子機構
区

分

職

名

氏

主

査

准教授

藤本 龍

副

査

教授

安田 剛志

副

査

教授

宇野 雄一

副

査

副

査
要

名

旨

Brassica rapa 種に属するハクサイ, コマツナ, カブ等のアブラナ科野菜の生産現場では病害が多発し
問題となっている。白さび病はコマツナでの最重要病害で, 菌はやや低温で湿気のある環境を好むため,
梅雨時期と秋雨から晩秋時期の被害が大きい。罹病すると葉に白い粉状の大小様々な斑点ができ, 葉身を
可食部とするアブラナ科葉菜類は商品にできず, 全国どこの産地でも問題になっている。萎黄病は, 罹病
すると葉が萎れてしまい, 収穫に至らずに枯死してしまう。萎黄病菌は土壌伝染するため, 耕種的防除が
難しく, 登録農薬がほとんどないため, 一度発病するとしばらくの間は作付けすることができない。よっ
て, 両病害において抵抗性品種の開発が重要となる。大量サンプルでの試験を可能にする幼植物の段階で,
環境による影響を受けず, かつ複数の病害抵抗性を同時に判定できる DNA マーカー選抜の導入が, 品種
育成の効率化, 更には複合病害に抵抗性を示す高度病害抵抗性品種の開発において重要となる。これまで
に B. rapa 種での白さび病菌に対する植物免疫応答や, 植物免疫応答におけるサリチル酸の役割について
明らかにされていなかった。また, タンパク質をコードしない 200 ヌクレオチド以上の RNA である long
noncoding RNA (lncRNA)の発現が病原菌の感染によって影響を受けるかは, B. rapa 種において知見が少
なかった。本学位論文は, 萎黄病抵抗性遺伝子の同定と DNA マーカーの開発, そして萎黄病菌と白さび
病菌の感染による lncRNA 発現変動や白さび病菌感染における植物免疫応答機構とサリチル酸の役割を
明らかにすることを目的とし, その成果を取りまとめたものである。本学位論文は, 6 章で構成されてい
る。
第 1 章では, Brassica 属を中心に宿主植物の病害抵抗性機構の研究知見をまとめている。
第 2 章では, B. rapa 種を用いて, 萎黄病菌 (Fusarium oxysporum f. sp. rapae ; Fo-rapae)に対する抵
抗性遺伝子の同定を行った。Fo-rapae 菌に対して抵抗性を示す系統と罹病性を示す系統を交配して得ら
れた F2 集団 (〜150 個体), 3 組合せについて接種試験を実施した。3 つの集団全てにおいて, 萎黄病抵抗
性遺伝子は単因子顕性の遺伝様式を示した。そして, 3 つの集団全てにおいて, 抵抗性を示した 15 個体と
罹病性を示した 15 個体から, DNA を抽出して QTL-seq 解析を実施した。その結果, QTL が F. oxysporum
f. sp. conglutinans の抵抗性遺伝子として同定されている FocBr1 の座乗する領域に見出された。そこで,
罹病性系統の FocBr1 の全塩基配列を決定したところ, 抵抗性を示した FocBr1 に対して幾つかのアミノ
酸変異が見られた。罹病性系統の FocBr1 遺伝子発現を調べたところ, 抵抗性系統の FocBr1 と同程度の
発現レベルを示した。以上の結果から, 罹病性系統は, アミノ酸変異により FocBr1 遺伝子の機能喪失が
起こることで罹病性となった可能性が考えられた。よって, 罹病性型の遺伝子を focbr1-2 と名付けた。

AKTER MST ARJINA
氏 名
そして, FocBr1 と focbr1-2 を区別できる DNA マーカー (focbr1-2m)を作出した。DNA マーカ
ー (focbr1-2m)を用いて市販のハクサイ 138 品種について抵抗性予測を行ったところ, ハクサイで
は 7 品種のみ FocBr1/focbr1-2 のヘテロ接合型を示し, focbr1-2 /focbr1-2 のホモ接合型を示す品種
は存在しないことから, ハクサイではこの変異 (focbr1-2)によって罹病性を示す品種は存在しない
ことが明らかとなった。一方, コマツナ 35 品種では, FocBr1/focbr1-2 のヘテロ接合型が 9 品種,
focbr1-2 /focbr1-2 のホモ接合型が 5 品種見出された。よって, コマツナでは focbr1-2 対立遺伝子を
有する品種が多く, 品種育成において focbr1-2 による罹病性のリスクが高いことが明らかとなっ
た。
第 3 章では, 萎黄病抵抗性系統と罹病性系統において, 萎黄病菌感染後 24 時間と 72 時間で発
現が変動する遺伝子のうち, lncRNA の一種である Natural Antisense Transcripts (NATs)と重複
する 12 遺伝子を同定した。12 遺伝子の中から 6 遺伝子に着目し, 萎黄病菌感染後 24 時間と 72 時
間について mRNAs と NATs の発現レベルを RT-qPCR により調べた。感染前後の発現変動率につ
いて, mRNA とペアとなる NAT で比較したところ, 有意な正の相関関係 (r = 0.69, p < 0.001) が
見られた。この結果から, 萎黄病菌感染による mRNA の発現変動に NAT が重要な役割を担ってい
る可能性が示唆された。
第 4 章では, コマツナの 2 品種で共通してサリチル酸処理後 72 時間で発現が変動する遺伝子の
うち, NATs と重複する 33 遺伝子を同定した。4 遺伝子に着目し, サリチル酸処理後 12, 24, 48, 72
時間について mRNAs と NATs の発現レベルを RT-qPCR により調べた。そのうち 2 組は, mRNA
とそのペアになる NATs との発現レベルの間に, 有意な正の相関関係が見られた。これらの結果か
ら, mRNA とそのペアとなる NAT の発現変動の関連性が宿主植物のサリチル酸応答に重要な役割
を担っている可能性が示唆された。
第 5 章では, 白さび病菌に対する宿主植物の免疫応答について明らかにした。白さび病抵抗性品
種と罹病性品種について, 白さび病菌感染後 48 時間と 72 時間のサンプルを用いてトランスクリプ
トーム解析を実施し, 白さび病菌感染により発現が変動する遺伝子を同定した。白さび病菌感染後
48 時間において, 抵抗性品種では 1,002 個の発現誘導遺伝子と 733 個の発現抑制遺伝子が見出さ
れ, 罹病性品種では 865 個の発現誘導遺伝子と 498 個の発現抑制遺伝子が見出された。そのうち,
497 個の発現誘導遺伝子と 271 個の発現抑制遺伝子が抵抗性品種と罹病性品種で共通していた。白
さび病菌感染後 72 時間において, 抵抗性品種では 716 個の発現誘導遺伝子と 743 個の発現抑制遺
伝子が見出され, 罹病性品種では 722 個の発現誘導遺伝子と 687 個の発現抑制遺伝子が見出され
た。そのうち, 266 個の発現誘導遺伝子と 301 個の発現抑制遺伝子が両品種で共通していた。抵抗
性品種または罹病性品種の白さび病菌感染後 48 時間または 72 時間における発現誘導遺伝子または
発現抑制遺伝子を用いて Gene ontology (GO) 解析を行った。抵抗性品種で発現が変化した遺伝子
の多くは, 防御応答に関連するカテゴリー（全身獲得抵抗性, プログラム細胞死など）やサリチル酸
に関連するカテゴリーに分類された。一方, 罹病性品種で発現が変化した遺伝子には, これらのカ
テゴリーに分類される遺伝子は見出されなかった。本研究により, 白さび病抵抗性においてはサリ
チル酸を介した過敏感反応が重要な役割を担っていることが示唆された。
第 6 章では, 第 2 章から第 5 章で得られた結果と他のグループの Brassica 属を用いた病害抵抗
性機構, さらには, DNA マーカー選抜による高度病害抵抗性品種開発への展望をまとめた。
本研究は, アブラナ科葉根菜類の病害抵抗性の分子機構について多くの知見を得たものとして価
値ある集積であると認める。よって学位申請者の AKTER MST ARJINA は, 博士 (農学)の学位を
得る資格があると認める。