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計算化学を活用した神経変性疾患に関与するタンパク質間相互作用阻害剤・酵素活性調節剤の同定

平山, 和徳 東京大学 DOI:10.15083/0002004317

2022.06.22

概要

近年、疾患標的タンパク質の構造解析が進んでおり、リガンドとの共結晶構造が取得されている場合も増加している。そのような疾患標的タンパク質の中には、既存の治療薬が乏しくアンメットニーズが高い神経変性疾患（難治性神経変性疾患）に関わるタンパク質も含まれている。そこで、難治性神経変性疾患のメカニズムの解明や創薬につながる化合物を計算化学でのバーチャルスクリーニングにより予測し、生化学、特に酵素学的な手法で検証することで、阻害剤や活性促進剤などの活性調節剤を同定することができないかと考え、以下の3つの課題について研究を行った。

(1)SOD1G85R変異体-tubulin相互作用阻害剤のバーチャルスクリーニング治療が困難である筋萎縮性側索硬化症の治療薬開発に応用可能性のあるSOD1G85R変異体とtubulinのタンパク質間相互作用(PPI)阻害剤取得、およびSOD1G85R変異体とのPPIに関与するタンパク質との相互作用阻害剤開発につながる手法の確立を目指した。

PPI阻害剤のスクリーニングについては、共同研究先の国立精神・神経医療研究センターにてSOD1-Derlin-1結合部位(N末端5-18)の近傍(N末端1-23)で、SOD1G85R変異体がtubulinと相互作用することを解明している。そこで、結合部位が既知であるtubulin相互作用をテストケースとして、ALS治療薬開発のためにSOD1のPPI阻害剤の同定を試みた。SOD1G85R変異体の構造情報(PDBID:2vr6)が知られており、tubulin結合部位が同定済みであることから、この結合部位にてSOD1G85R変異体に対して、ドッキングシミュレーションを行った。化合物ライブラリーはChemBridge社のCNS-Set化合物を用いた。

SOD1G85R変異体上のtubulin結合部位に対するドッキングシミュレーション上位化合物の阻害活性を測定したところ、アッセイ可能であった6化合物のうち5化合物がSOD1-tublin相互作用を阻害することを確認し、SOD1G85R変異体のPPI阻害剤の取得に成功した。ドッキングシミュレーションの結果から、PPI阻害剤はTrp32の芳香環パイ電子との相互作用により、SOD1G85R変異体のtubulin結合部位に結合していると考えられた。

本研究で同定した5化合物の共通骨格の抽出は、酵素阻害剤で実施したバーチャルスクリーニングとは異なり困難であるが、芳香環、ヘテロ5員環、N-C=O構造が阻害剤5化合物に共通しており(図1の化合物1,3,8,9,10)、阻害活性がなかった化合物にはヘテロ5員環が含まれないことが明らかとなった。

(2)バーチャルスクリーニングによるUCH-L3阻害剤の同定
バーチャルスクリーニングの手法検証(バーチャルスクリーニングで取得した化合物がドッキングシミュレーションで指定した結合部位に結合していることの検証)と創薬上で有用な化合物の取得を目的として、ユビキチンのC末端の付加物を加水分解する酵素であるubiquitinC-terminal hydro lases L（UCH-L）ファミリータンパク質を標的としたバーチャルスクリーニングと実験による化合物の活性測定を行った。とくに、活性を阻害することによりアポトーシス促進作用が期待されるUCH-L3を対象とした。バーチャルスクリーニングでは、リガンドであるユビキチンアナログとUCH-L3との共結晶構造(PDBID:1XD3)を活用してドッキングの結合部位を絞り込み、ChemBridge社のCNS-Set化合物に対するドッキングシミュレーションを実施した。ドッキングシミュレーションでの上位10化合物のうち、9化合物のUCH-L3加水分解活性の阻害効果を酵素学実験にて検証した。3化合物が統計的に有意な阻害活性を示した。さらに詳細な解析の結果、これら3化合物は、IC50値が100M程度であり、非特異的な阻害作用ではなく、UCH-L3の活性中心に結合し濃度依存的に阻害活性を示すことが示された。阻害活性を有する3化合物はジヒドロピロール基を共通骨格として持っており(図3)、新規母核として有用であると考えられる。

(3)バーチャルスクリーニングによるUCH-L1活性調節剤の同定
UCH-L1については、活性の促進によりベータアミロイド誘引性のシナプス機能・文脈記憶の低下を抑制できることが期待される実験結果が報告された(Gongetal.,2006)ことから、阻害剤だけでなく、活性促進剤の取得を目的とした。

UCH-L1のアポ構造(PDBID:2ETL)を用いて、UCH-L3との相同性やUCSFDOCKによる結合ポケット検出により、ドッキングで用いる結合部位を決定した。その結合部位を用いて、GOLDにてCNS-set化合物のドッキングシミュレーションにより、5化合物を活性調節剤候補として同定した。

次スクリーニングにおいて化合物A3を同定し、化合物A3はUCH-L1の加水分解活性を上昇させる活性促進剤であることを明らかにした。その後の2次スクリーニングにおいて阻害剤B2を同定し、化合物B2は最終濃度48.0MにてUCH-L1の加水分解活性を86.2%阻害することを明らかにした。

PPI阻害剤と酵素阻害剤のファーマコフォアに関する特徴を比較すると、同じ化合物ライブラリーをスクリーニングしているにも関わらず、両者には違いが見られる。UCH-L3などの酵素阻害剤のように酵素タンパク質等に存在する明瞭な結合ポケットを標的としている化合物においては、2次元の構造式レベルでもファーマコフォアが抽出可能である場合が多い一方で、本研究で同定したようなPPI阻害剤においては、ドッキングポーズのような3次元情報を利用して分析することで初めてファーマコフォア仮説が抽出可能となると考えられる。

一般的に、PPI阻害剤の取得は困難であるが、本研究で実際にPPI阻害剤が取得できた要因を考察する。第一に、既知の結合部位を利用したことで成功確率が上がったと考えられる。我々は、SOD1-Derlin-1結合部位(SOD1N末端5-18)の近傍(SOD1N末端1-23)で、SOD1G85R変異体がtubulinと相互作用することを報告しており、この知見を活用することでPPI阻害剤の取得が可能になったと考えられた。バーチャルスクリーニングで取得したUCH-L3の阻害剤は、バーチャルスクリーニングの際に指定した基質結合部位に特異的に結合していることを明らかにしている。このことから、PPIにおいては結合界面の特徴は異なるものの、指定した結合部位に対する阻害剤の取得が可能であったと考えられる。

第二に、ドッキングシミュレーションにおいて、重要な相互作用を捕らえることができた可能性がある。芳香族相互作用はタンパク質-リガンド相互作用の重要な構成要素とされており、SOD1G85R変異体のTrp32とパイ電子間相互作用を形成できる化合物は、ある程度の親和性でSOD1G85R変異体のN末端に結合できているため、tubulinとの結合阻害作用を有していると解釈できる。ドッキングソフトウェアでは芳香族相互作用をファンデルワールス相互作用と静電相互作用の枠組みの範囲内で扱っており、厳密な計算を行っているわけではないが芳香族相互作用は十分再現できているとされている(Brylinskietal.,2018)。本研究では実際にバーチャルスクリーニング中に芳香族相互作用につながる相互作用の計算が阻害剤の予測に寄与した可能性がある。SOD1G85R変異体のTrp32との相互作用は複数のドッキングツールで共通してみられており、SOD1G85R変異体とtubulinのPPI阻害において重要な相互作用である可能性が示唆された。

以上のように、結合部位に関する事前情報を活用することで、神経変性疾患に関与するタンパク質に対して、PPI阻害剤や酵素活性調節剤を同定することができることを実証した。リード化合物を取得する方法としてバーチャルスクリーニングと実験検証は有効であるが、細胞膜透過性などinvitro実験に活用可能な化合物を取得するためには化合物の物性予測技術の向上が重要になると考えられる。

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