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Bone morphogenetic protein-2 enhances gonadotropin-independent follicular development via sphingosine kinase 1

伊東 雅美 富山大学

2020.12.23

概要

【目的】
卵巣刺激に対する反応性が低いpoor ovarian response(POR)女性が挙児を希望し、体外受精を行ったとしても得られる卵子数は少なく妊娠率は低い。このような患者の卵巣には多くの2次卵胞が存在するものの、卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone：FSH)投与によっては、これらの初期卵胞を排卵直前の成熟卵胞まで誘導することはほとんどできない。よってPOR患者には新たな治療戦略が必要である。Bone morphogenetic protein(BMP)は細胞外シグナル伝達分子であり、様々な細胞種で細胞増殖、細胞分化、アポトーシスを調節している。BMPは哺乳類雌の生殖生理にも関連しているが、BMPがどのようにゴナドトロピン(gonadotropin: Gn)非依存性の初期卵胞発育に影響するかは不明であった。一方、Sphingosine1-phosphate(S1P)はGn非依存性に卵胞発育を誘導することが知られている。S1Pは生理活性のある脂質メディエーターでありHippopathwayを抑制する。S1Pはsphingosinekinase1(SPHK1)が触媒するsphingosineのリン酸化によって産生されるが、初期卵胞におけるSPHK1の制御は明らかになっていない。そこで、本研究では初期卵胞発育におけるBMP-2の役割を明らかにするために、BMP-2のSPHK1に対する作用を検討した。さらにBMP-2が顆粒膜細胞(granulosa cells: GCs)数増加を起こす機序としてBMP-2とHippo pathwayの関与について検討した。

【方法並びに結果】
以下の5つの実験を行った。結果を同時に示す。
1.ヒト初期卵胞にSPHK1が発現している。卵巣摘出患者の卵巣病理切片を免疫組織染色し、初期卵胞のSPHK1の発現を調べた。ヒト卵巣において初期卵胞のGCsにSPHK1の発現を認めた。
2．BMP-2は、GCsにおいてSPHK1とFSH受容体(FSHreceptor：FSHR)のmRNA発現を上昇させる。また、BMP-2はウシGCs数を増加させる。ウシGCsとヒト非黄体化顆粒膜細胞株(humannonluteinized granulosacellline：HGrC1)を用い、BMP-2によるSPHK1とGCs分化の契機となるFSHRのmRNA発現を検討した。GCs数増加作用をWST-8assayで検討した。その結果、BMP-2はウシGCsとHGrC1細胞においてSPHK1のmRNA発現を有意に上昇させた。BMP-2はウシGCs数を有意に増加させた。初代ウシGCsにおいてBMP-2はFSHRmRNA発現を有意に上昇させた。
3.S1PはウシGCs数を増加させる。S1PをウシGCsに作用させるとday2の時点で300nMのS1Pを投与することでday0に比べ約1.14倍細胞数が増加した。
4．S1PはHippo pathwayを抑制する。Hippo pathwayの下流転写調節分子にYes-associated protein(YAP)があるが、Hippo pathwayの抑制効果について、WesternblotにおけるphosphorylatedYAP(pYAP)の発現と、免疫細胞染色におけるYAPの局在を検討した。YAPの標的遺伝子であるconnective tissue growth factor(CTGF)のmRNA発現を確認した。ウシGCsに300nMS1Pを作用させたところ、pYAPを48%減少させ、YAPの核内移行を観察した。また、S1PはウシGCsにおいてCTGFmRNA発現も有意に上昇させた。
5．BMP-2もHippopathwayを抑制する。BMP-2によるHippopathway抑制効果についてS1Pを用いた実験と同様の手法で検討した。阻害実験にはYAP阻害剤であるverteporfin(VP)を用いた。BMP-2はウシGCsにおいてpYAPを25%減少させ、YAPの核内移行も促進させた。また、VP投与によりBMP-2誘導性ウシGCs数増加作用は打ち消された。

【総括】
１）ヒト初期卵胞のGCsにおいてSPHK1の発現が認められる。
２）BMP-2はウシGCsとHGrC1細胞においてSPHK1mRNA発現を上昇させ、ウシGCsの細胞数を増加させる。
３）BMP-2とS1PによるHippopathway抑制作用については、BMP-2の作用はS1Pに比べて弱く、作用発揮までに時間がかかる(pYAP減少：S1Pは48%、BMP-2は25%。YAPの核内移行：S1Pは1時間、BMP-2は16時間)。BMP-2のHippopathwayに対する微弱な作用は長時間を要する生理的な初期卵胞発育過程に合致すると考えられた。
４）BMP-2は初代ウシGCsにおいて、FSHRmRNA発現も上昇させる。以上より、SPHK1が触媒するS1Pレベルの上昇を介してBMP-2がGn非依存性GCs数の増加を誘導することを初めて明らかにした。また、BMP-2は初期卵胞発育において、GCs数増加作用だけでなく細胞分化にも関与していることを明らかにした。

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