Histochemical examination of peri-implant bone induced by a combination material of phosphorylated pullulan and beta-tricalcium phosphate in a rat bone defect model [an abstract of entire text]

概要

インプラント治療において安定した状態を維持するためには，インプラントと新生骨の良好なオッセオインテグレーション，ならびに，インプラント周囲に十分な骨量を確保する必要がある．インプラント埋入部位の骨量が不十分である場合には，自家骨あるいはハイドロキシアパタイトやβリン酸三カルシウム（βTCP）などの骨補填材を埋入し，再生骨を誘導する必要がある．ハイドロキシアパタイトやβTCPは，生体親和性や骨伝導性を有する一方，顆粒状の骨補填材として用いられることが多く，欠損部での保持が難しい欠点がある．リン酸化プルラン（phosphorylated pullulan: PPL）は，多糖類であるプルランに多数のリン酸基が付与されており，石灰化骨基質やβTCPなどの結晶性カルシウム（Ca）と結合する性質を有する．このことから，βTCPとPPLを混和した複合材料は，骨欠損部でPPLがβTCPや石灰化した骨基質と化学的に結合することで顆粒状のβTCPを接着・保持し，良好な骨再生を誘導する可能性が推測される．そこで本研究では，βTCPとPPLの複合材料をインプラント周囲の骨補填材として用いた場合の骨再生を組織化学的に検索した．

　生後10週齢雄性Wisterラットの脛骨前面に，麻酔下で直径1.4mmの窩洞を形成した．これら窩洞に，1）PPLゲル状液2mg（PPL群；50mgのPPLを80μlの2%CaCl2溶液に溶解し作成），2）βTCP2mg（βTCP群；平均顆粒径100-250μm），3）PPL溶液とβTCPを重量比2：8の比率で混和した複合材料2mg（βTCP+PPL群）の骨補填材を填入後，直径1.7mm長さ3.0mmのチタンインプラント（universal titan bone screw®）を埋入した．なお，コントロール群として，骨補填材を填入せずにインプラントのみを埋入した群を作成した．埋入1，2，4週間後に4%パラホルムアルデヒド溶液で灌流固定し，脛骨を摘出後，インプラント埋入部位をマイクロCTにて撮影した．一部の脛骨を10%EDTA溶液で脱灰した後，通法にてパラフィンに包埋し，H-E染色，組織非特異型アルカリホスファターゼ（ALP），osteocalcin，dentin matrix protein-1（DMP-1）免疫組織化学，ならびに，酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）酵素組織化学を行った．他の同部位試料は，インプラント周囲骨からtotal RNAを抽出し，Alp，Osteocalcin，Dmp-1，Integrinαv，Integrinβ3，Trapの遺伝子発現をreal time PCRにて解析した．

　コントロール群では，埋入1週間後にインプラント周囲に多数の骨梁状の新生骨を認めたものの，それら骨梁は経時的に減少していた．埋入4週後には，インプラント体表面に薄い板状の骨を残すのみであり，その周囲には骨梁はほとんど存在せず骨髄と脂肪組織で満たされていた．βTCP群では，埋入1,2週間後でインプラント体からやや離れたところに位置するβTCP顆粒表面にも新生骨が認められた．埋入4週後において，インプラント体表面に薄く形成された骨は，周囲に存在するβTCP顆粒上の新生骨と極わずかにしか連結していなかった．また，インプラント周囲の骨量は減少しており，骨髄と脂肪組織で満たされていた．一方，PPL群とβTCP+PPL群では，時間経過とともにβTCP顆粒およびPPL上に新生骨が形成されていた．これらの群において，埋入1週間後に形成された新生骨の量は，コントロール群やβTCP群と比較して少なかったが，4週間後には増加しておりインプラント周囲に多数の太い骨梁が発達していた．また，インプラント体表面には厚い新生骨が形成され，周囲のPPL/βTCPや骨梁と連結していた．PPL群とβTCP+PPL群では，埋入4週間後に骨髄と脂肪組織で満たされることはなく，Integrinαv，Integrinβ3遺伝子の発現がコントロール群やβTCP群と比較して有意に上昇していたことから，PPLの存在により活発な細胞の遊走・定着が示唆された．

　骨形成評価の指標として，骨芽細胞のマーカー酵素であるALP，結晶性Caとの結合能を有するosteocalcinとDMP1の免疫組織化学およびreal time PCR解析を行った．コントロール群では，埋入1週後ではALP陽性骨芽細胞がosteocalcin陽性を示す新生骨表面に局在しており，Alp，osteocalcin，Dmp-1発現が上昇していたが，経時的に骨量が減少し，埋入4週後にはこれら遺伝子発現が低下していた．βTCP群では，埋入1,2週後にALP陽性骨芽細胞は新生骨およびβTCP顆粒表面に認められた．βTCP顆粒表層にはosteocalcin陽性反応およびDMP-1陽性反応が観察されたが，これら蛋白がβTCPに吸着したものと推察された．埋入4週後には，コントロール群と同様に，骨量減少ならびにAlp，osteocalcin，Dmp-1発現低下が認められた．一方，PPL群やβTCP+PPL群では，ALP陽性骨芽細胞が新生骨やβTCP顆粒のみならずPPL表面にも認められ，Alp，osteocalcin，Dmp-1発現は埋入1週後ではコントロール群やβTCP群と変わらなかったが，埋入4週後には有意に高い値を示した．osteocalcinおよびDMP-1はPPL表面にも局在し，その上に骨芽細胞または新生骨が局在する組織像が観察された．PPLはリン酸残基を介してCa2+などと結合することを考えると，骨芽細胞や骨細胞が産生したosteocalcinやDMP-1などの骨基質蛋白はCaとともにPPL表面上に保持され，新生骨の石灰化誘導に寄与する可能性が推測された．

　骨吸収の評価としてTRAP酵素組織化学を行うと，コントロール群やβTCP群では，TRAP陽性破骨細胞は新生骨やβTCP顆粒表面に認められ，埋入4週後までにTRAP陽性破骨細胞の数やTrap遺伝子の発現が減少していた．一方，PPL群およびβTCP+PPL群では，埋入4週間後においても多数のTRAP陽性破骨細胞が認められ，Trap遺伝子の発現も有意に上昇していたことから，依然として骨改造が維持されている可能性が示唆された．

　以上より，PPLは，βTCPを骨欠損部に保持させるだけでなく，PPL自身も骨芽細胞が定着する足場材として機能し，PPL上に，直接，骨形成を誘導することが示唆された．また，PPL含有複合材料による骨形成は緩やかに生じる一方，最終的には太い骨梁からなるインプラント周囲骨を形成することが示唆された．PPL含有複合材料は，βTCPのCaおよびCa2+ならびに骨芽細胞や骨細胞が産生するosteocalcinやDMP-1などの骨基質蛋白をPPLの表層に吸着・保持させて，新生骨の骨基質石灰化誘導に寄与する可能性が推測された．