水生昆虫シルクナノ繊維と3次元織布技術を用いる幹細胞培養足場材料開発

概要

３版

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９ （共通）

科学研究費助成事業  研究成果報告書
平成 ３０ 年

６ 月 ２５ 日現在

機関番号： １３６０１
研究種目： 基盤研究(B)（一般）
研究期間： 2014 ∼ 2017
課題番号： ２６２８８１０１
研究課題名（和文）水生昆虫シルクナノ繊維と3次元織布技術を用いる幹細胞培養足場材料開発

研究課題名（英文）Silk nanofibers of aquoue insects and new biomaterials

研究代表者
塚田 益裕（Tsukada, Masuhiro）
信州大学・繊維学部・特任教授

研究者番号：２０４１４９２２
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

12,500,000 円

研究成果の概要（和文）：ヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)のE2Pタンパク質、および蚕シルク
(SF)との混合系膜におけるMC3T3-E1細胞の付着増殖評価によると、E2P膜は、SF膜より細胞接着性は良好であっ
た。SFと生体適合性高分子のシルク複合ナノファイバー表面ではNIH3T3細胞が、SFとポリ乳酸(PLA)の複合ナノ
ファイバー表面では、ヒトの角膜実質細胞が良好に付着増殖することが検証された。水生昆虫のE2Pタンパク質
膜およびシルク複合ナノファイバーは、細胞足場材として有効であることが示唆され、今後の再生医療技術の発
展に必要なバイオ材料として利用できる展望を開くことが可能となった。

研究成果の概要（英文）： The goal of our research program is to produce silk protein materials from
S. marmorata, aqueous insect, which can be used as a scaffold for tissue engineering. We prepared
then the silk protein film, made of E2P, which contains Smsp-1 core component from aqueous silk
fiber. E2P transparent film prepared thus was insolubilized by heat and/or ethanol treatment. E2P
film enhanced MC3T3-E1 osteoblast-like cells. These findings suggest E2P film confirmed to be an
efficient bioactive protein to mediate cell-biomaterial interaction.
Additionally, we are succeeded in preparing the SF composite nanofibers made of silk fibroin and
compatible high polymers. Silk composite nanofibers showed that the incorporation of SF into
compatibles high polymers enhanced Murine fibroblasts [NH3T3] cell or human keratinocytes cell
adhesion and proliferation. These findings suggest silk composites materials confirmed to be an
efficient bioactive protein to mediate cell-biomaterial interaction.

研究分野： 生体高分子
キーワード： E2Pタンパク質 蚕シルク 細胞接着 ナノファイバー 細胞足場材

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９、ＣＫ−１９（共通）
１．研究開始当初の背景

して有望となるであろう。水生昆虫シルク

ヒ ゲ ナ ガ カ ワ ト ビ ケ ラ (Stenopsyche

における有用細胞の付着増殖性を実証する

marmorata) の幼虫が水中で吐出するタン

ことができれば、バイオ材料化が可能とな

パク質シルク (水生昆虫シルク) は、河川

り、特に需要の高い骨・軟骨再生医療分野

中の小石と接着でき、優れた 「濡れ・接着

での広範な利用が期待できるであろう。

特性」を有する特徴ある天然繊維材料であ
る。水生昆虫シルクは、我々が最近分離に

２．研究の目的

成功した独自の新材料で、水に触れて凝固

①足場材料の設計・作成および知財管理

する特性があり、カルシウム等を吸着する

水生昆虫シルクに SF を混合したシルク

機能があることが検証された。水生昆虫か

膜を製造し、その基本物性および細胞接着

ら分離できる機能性タンパク質の等電点は

への影響を調査する必要がある。

中性領域にあること、リン酸化を受けた生

水生昆虫シルクの代わりに SF とメタク

体高分子であることが当該研究により解明

リルレートとのシルク複合体、あるいは SF

され、骨芽・軟骨芽細胞や間葉系幹細胞と

と生体適合性のポリ乳酸とのシルク複合体

の適合性が高いものと期待できる。有用細

を電界紡糸してシルク複合体ナノファイバ

胞を付着増殖する機能を備えているものと

ーを製造し、シルク複合ナノファイバーへ

の推定から、将来は、再生医療分野にも応

の NIH3T3 細胞あるいはヒトの角膜実質細

用できるだろう。

胞(Keratocyte)の付着・増殖性を評価する。

我々は、水生昆虫シルクを構成する超高

②水生昆虫の集団動態解析,シルク材料の

分子量タンパク質の Smsp-1 (Stenopsyche

相関調査、および, 水生昆虫試料種選定・

marmorata silk protein-1) が水生昆虫シ

提供および品質管理

ルクのコア成分であること、Smsp-1 がリン

千曲川中流域の河道内に優占するトビケ

酸化セリン (pS) を含む親水性の高いタン

ラ類を対象に、生活史のパターン等を推定

パク質であることを解明した。Smsp-1 につ

する。

いて、pS を含む (pSX)nE モチーフと Ca2+

③細胞培養実験・データ解析と管理

のイオン対を介した分子間・分子内相互作

水槽で飼育・吐糸したシルク繊維から、

用による繊維形成・接着機構が提唱されて

シルクタンパク質の直接可溶化を試みる。

いる。

シルクナノ繊維素材のリン酸化組換えシル

他方、生物由来材料の蚕シルク( SF) は

ク蛋白質調製への将来的な応用を目指す。

高い生体適合性を示し、加工が比較的容易

④昆虫捕獲の適切時期特定のための時系的

なため細胞足場基材としての研究が進展し

遺伝子解析

ているが、疎水性寄りのアミノ酸組成であ

水生昆虫体内の絹糸腺からより高品質で

ることから細胞接着性には工夫の余地があ

多量のシルクタンパク質を得ることができ

る。親水性の水生昆虫シルクは SF に代わ

るため水生昆虫が棲息する水環境との関係

る新規材料として期待できるが、その収集

で時系列的遺伝子解析が必要である。

効率は SF と比べて劣悪である。

⑤水生昆虫シルクタンパク質の遺伝子発現

生化学特性に優れていると想定できる水
生昆虫シルクから比表面積が広い「ナノフ

動態解析とその結果に基づく素材改良の検
討

ァイバー」が製造でき、生体細胞との接着

水生昆虫シルクが新しいバイオ素材とし

増殖性が実証できれば、細胞培養用足場材

ての利用の可能性を論議し、水生昆虫シル

クナノ繊維を素材として再生医療技術の発

⑤水生昆虫シルクタンパク質の遺伝子発現

展加速のため新規足場材料の開発を目指

動態解析とその結果に基づく素材改良の検

す。水生昆虫の主要シルクタンパク質遺伝

討

子のクローニングおよび遺伝子発現動態解
析を進める。

絹糸腺内に主要なシルクタンパク質４種

S. marmorata silk protein (Smsp-1∼4)
の存在が発見でき、Smsp-1 の cDNA 断片の

３．研究の方法

クローニングを行った。Smsp-2,3,4 につい

①足場材料の設計・作成および知財管理

ても、各 N 末端アミノ酸配列をもとに設計

水生昆虫の 5 齢幼虫を採集し、2 段階抽

した縮重プライマーを利用し、絹糸腺 cDNA

出法(60℃で 30 分抽出処理)でタンパク質

ライブラリーから Smsp-2,3,4 をコードす

(E2P と Smsp-1 を含む）を抽出した。

る遺伝子(cDNA)のクローニングを行う。繊

シルク複合ナノファイバーを医用分野に

維状シルク及び絹糸腺タンパク質を電気泳

応 用 す る た め 、 SF と 水 溶 性 高 分 子

動により分離し、
ゲル内トリプシン消化後、

(HEMA/HBA)とのシルク混合物あるいは SF

質量分析測定及び絹糸腺 cDNA 配列情報を

と生体適合材料であるポリ乳酸(PLA)との

利用したタンパク質の同定を実施した。

シルク混合物を電界紡糸してシルク複合ナ
ノファイバーを製造する。シルク複合ナノ

４．研究成果

ファイバー表面における NIH3T3 細胞ある

①足場材料の設計・作成および知財管理

いはヒトの角膜実質細胞(Keratocyte)の付

SF あるいは水生昆虫シルク・E2P により

着・増殖性を評価した。

作製したシルク膜は無色透明であり、双方

②水生昆虫の集団動態解析,シルク材料の

のシルクを 0.5 w/v % ずつ含むシルク混合

相関調査、および, 水生昆虫試料種選定・

膜 (条件 5) は最も白くなった。Pk に対す

提供および品質管理

る EDS 解析から、シルク膜中の E2P 含有率

上田市常田地区の瀬と流程の異なる千曲

とリン元素(Pk) の存在割合は正の相関を

川中流域の岩野地区の瀬 2 地点で、トビケ

示し、シルク膜内の E2P が均一に混合され

ラ群集を各地点で 3 回採集し解析に用い

ていることが確認された。

た。
③細胞培養実験・データ解析と管理
シルクタンパク質にタンパク質変性剤を

水生昆虫シルクの E2P と SF の各シルク
溶液を混合して作製したシルク膜は、相分
離することなく混合比の通り均一に分散し

作用させて可溶化する技法を試み、シルク

ていることが EDS 解析により示唆された。

タンパク質収量の評価を行った。水生昆虫

シルク膜に播種した MC3T3-E1 細胞観察に

絹糸腺由来プロテインキナーゼ遺伝子の探

より、E2P 添加によりシルク膜の親水性が

索及びクローニングを実施する。

高まり、良好な細胞接着をもたらしたもの

④昆虫捕獲の適切時期特定のための時系的

と考えられる。

遺伝子解析

繊維径 360 nm のシルク複合(SF/PLA)ナノ

水生昆虫の絹糸腺からシルクタンパク質

ファイバー表面では NIH3T3 細胞あるいは

を精製する手法を改良し、より多量で高品

ヒトの角膜実質細胞(Keratocyte)が効率的

質の試料を取り出すため昆虫捕獲のための

に付着増殖することが検証でき、細胞の足

適切な時期を特定し、時系列的遺伝子解析

場材としての有用性が確認できた。

および水温との相関を調べた。

②水生昆虫の集団動態解析,シルク材料の

およそ 40-50% であり、絹糸腺からのシル

相関調査、および, 水生昆虫試料種選定・

クタンパク質主成分精製と比較して操作効

提供および品質管理

率を向上させることが可能となった。

ヒゲナガカワトビケラのような大型個体

飼育水槽内で吐糸されたシルク繊維か

種では、一個体あたりに確保できるタンパ

ら、シルクタンパク質を直接可溶化させる

ク量は比較的多いが、環境耐性に相対的に

ことに成功した。タンパク質組成物はカル

弱く、洪水などの環境かく乱要因を直接受

シウムイオン等の刺激により瞬時に凝固す

けると個体群へのダメージが大きく、回復

ることが見出され、医用性機能バイオ材料

も遅いことを確認した。一方、ウルマーシ

として広範に利用できる展望を見出すこと

マトビケラやウルマークダトビケラなど

ができた。

は、小型種であるために、大型種に比べて

⑤水生昆虫シルクタンパク質の遺伝子発現

内的自然増加率が高く、環境かく乱に対し

動態解析とその結果に基づく素材改良の検

て、相対的に強い傾向が認められたが、1

討

匹当たりのターゲットとなるタンパク量は

主要なシルクタンパク質の Smsp-2,3,4

少ないものと予想された。

の遺伝子クローニングにより、水生昆虫絹

③細胞培養実験・データ解析と管理

糸腺 cDNA ライブラリーから Smsp-2,3,4 を

キレート化合物およびタンパク質変成剤

コードする遺伝子(cDNA)のクローニング、

の共存環境下において、水生昆虫シルクタ

及び大腸菌による組換えタンパク質の発現

ンパク質主成分である Smsp-1 が可溶化で

に成功した。特に、Smsp-2 と Smsp-4 は、

きることを始めて確認した。飼育水槽内で

配列相同性検索の結果、有意な相同性を持

吐糸されたシルク繊維から直接可溶化した

つ既知タンパク質は無く、全く新規なタン

シルクタンパク質は、動物体内の組織間や

パク質であることが検証された。Smsp-2 の

体腔内中を満たす体液と等張な緩衝液に溶

アミノ酸配列は非常に特徴的な GYD 反復配

解する特異機能があるため、細胞の付着・

列モチーフから主に構成され、Smsp-4 のア

増殖のための足場材として利用できる可能

ミノ酸配列は、
特徴的な GW 反復配列モチー

性が示唆された。

フを多数含んでいることを明らかにした。

幼 虫 絹 糸 線 RNA-seq 解 析 結 果 か ら

さらに、水生昆虫のシルク繊維及び絹糸腺

Ser/Thr プロテインキナーゼと推定される

タンパク質の網羅的同定を行ったところ、

ものがいくつか見つかり、その中でも特に

Smsp-1∼4 以外にも、新規タンパク質を含

Fam20C ホモログに注目して遺伝子をクロ

む多くのタンパク質がシルクや絹糸腺に存

ーニングすることに成功した

在していることを見出した。例えば、絹糸

④昆虫捕獲の適切時期特定のための時系列

腺から、ナミアゲハチョウ由来 Protein

的遺伝子解析

disulfide isomerase (PDI)に高い相同性

シルクタンパク質遺伝子発現は採取時期

(65%)を示すタンパク質が新たに同定され

により若干異なる。幼虫ステージが 5 令と

た。PDI は、正しいジスルフィド結合の形

なる初夏において、シルクネット品質があ

成を触媒する酵素であり、Smsp-2, 3, 4 等

る程度保証されることがわかり、水温が低

をはじめ比較的多くの Cys を含むシルクタ

下する冬期にはシルクタンパク質合成 (翻

ンパク質のジスルフィド結合形成を促進す

訳) 活性が低下することが検証できた。可

る機能のあることが推測できた。また、水

溶化・回収される収率は、原料乾燥重量の

生昆虫のシルク繊維と絹糸腺の両方から、

クワコ由来 Serpin 2 に高い相同性(49%)を

fauna over the water surface in the

示す Y7-28 や、
新規蛋白質 Y11-82 が同定さ

middle reaches of the Shinano River,

れた。特に、Y11-82 では、アミノ酸配列内

Japan, mainly among Caddisflies

部に GPX や GGX からなる反復配列が多く、

(Trichoptera). Zoosymposia.

また SXE 型配列も多く現れ、Smsp-1 等と類

10:203-213. 査読有

似した特徴が確認できた。Y11-82 は水生昆

⑤ 平林公男 (2014)

3.2.3

中流域の多

虫特有かつ重要なシルク蛋白質である可能

様な川虫群集、水辺と人の環境科学

性が高い。

(中)

小倉・竹村・谷田・松田(共編)

朝倉書店 33-36. 査読有
５．主な発表論文等

⑥ Kobayashi, N, Inano, K, Sasahara, K,

〔雑誌論文〕
（計 7 件）

Sato, T, Miyazawa, K, Fukuma, T,

① Ryoichi Arai (2018) Hierarchical

Hecht, M.H, Song, C, Murata, K, and

design of artificial proteins and

Arai, R.(2018) Self-assembling

complexes

toward

synthetic

supramolecular nanostructures

structural

biology.

Biophysical

Reviews, 10, 391-410. 査読有

constructed from de novo extender
protein nanobuilding blocks, ACS

② P.Taddei, S.Tozzi, G. Zuccheri, S.

Synth. Biol. 7, 1381-1394.

Martinotti, E. Ranzano, V. Chiono, I.

DOI: 10.1021/acssynbio.8b00007

Carmagnola, and M.Tsukada (2017)

（査読有、
オープンアクセスではない）

Intermolecular interaction between

⑦ Arai, R.(2018) Hierarchical design

B.mori silk fibroin and

of artificial proteins and complexes

Poly(L-lactic acid) in electronspun

toward synthetic structural biology,

composite nanofibrous sacaffolds.

Biophys. Rev. 10, 391-410.

Materials Science and Engineering C

DOI: 10.1007/s12551-017-0376-1

70(2017),777-787.査読有

（査読有、
オープンアクセスではない）

③ Hirabayashi Kimio and Zukeran Hikari

(2017) Increase in environmental

〔学会発表〕
（計 5 件）

light

massive

① Arai, R. (2018) Hierarchical design

insects.

of artificial proteins and complexes

Proceedings of the 9th International

toward synthetic structural biology,

Conference on Urban Pests, Matthew P.

Biophys. Rev. 10, 391-410.

flights

conditions
of

boosts

aquatic

Davies, Carolin Pfeiffer and William
H

Robinson

(Edits.)

Printed

by

② Okada S., Choi S. and Hirabayashi K.
(2017) Secondary production of

Purepprint Group, Crowson House,

chironomidae (Diptera) in the

Uckfield, East Sussex TN22 1PH UK.

middle reaches of the Chikuma River.

45-51. 査読有

International Symposium on River and

④ Hirabayashi, K, Ikutama, E., Ohkawa,

K.，Arai, R., Nomura, T., Tsukada,

Lake Environment.
③ Denda M., Miyabara Y., Kitano S.,

M. and Abe K. (2016) Flight

Kayaba Y. and Hirabayashi K. (2017)

density of the aquatic insect

Development

and

verification

of

compartment model on production at

研究者番号：20222250

pool and riffle structure in middle
reach

of

the

Chikuma

river.

大川 浩作 (OHKAWA KOUSAKU)

International Symposium on River and

信州大学・学術研究院繊維学系・教授

Lake Environment.

研究者番号：60291390

④ Hirabayashi Kimio and Zukeran Hikari

野村 隆臣 (NOMURA TAKAOMI)

(2017) Increase in environmental

信州大学・学術研究院繊維学系・准教

light

授

conditions

boosts

massive

flights of aquatic insects. The 9th

研究者番号：90362110

International Conference on Urban
Pests. July 9-12.

新井 亮一 (ARAI RYOICHI)

⑤ 難波広樹，崔翔気，岡田峻典，大塚健
斗，平林公男 (2017),

千曲川中流域

におけるウルマーシマトビケラの二次
生産力の変動幅．日本陸水学会甲信越
支部会
〔産業財産権〕
○取得状況（計 1 件）
① 名称：血液凝固溶液、血液凝固溶液の
製造方法、および液体の血液塞栓性タ
ンパク質固有組成物 E2P の製造方法
発明者：結城一郎、大川浩作、他 4 名
権利者：信州大学、結城一郎
種類：特許
番号：特許第 6047689 号
取得年月日：2016 年 11 月 25 日
出願年月日：2015 年 03 月 26 日
国内外の別：国内
6. ...

この論文で使われている画像