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Compromised anti-tumor–immune features of myeloid cell components in chronic myeloid leukemia patients

原田 生起 横浜市立大学

2022.03.25

概要

1. 序論
慢性⾻髄性⽩⾎病 (Chronic Myeloid Leukemia: CML) は融合遺伝⼦ BCR-ABL に起因する⾻髄増殖性腫瘍の 1 つである. CML 患者の予後は, 恒常的なチロシンキナーゼ活性を有する BCR-ABL に対する阻害剤 (Tyrosine Kinase Inhibitor: TKI) によって, 劇的に改善した (Wong and Witte, 2004). しかし TKI 療法には T315I 変異などの耐性例や副作⽤, 服薬中⽌後の約 6割の患者における再発など様々な問題点がある (Mahon et al., 2010; Ross and Hughes, 2020).すなわち, CML は未だに根治できていない疾患である. 近年, 多くのがんで腫瘍に対する免疫療法が注⽬され, 中でも免疫チェックポイント分⼦ PD-1/PD-L1 の阻害抗体薬は, 固形腫瘍において複数の根治例が報告され (McGranahan et al., 2016; Ribas and Wolchok, 2018), ⼤きな期待が集まっている. CML は IFN-α 療法の有効例があることから, 腫瘍免疫に感受性があると考えられてきた (Biernacki et al., 2010; Talpaz et al., 2013). しかし, CML を発症した患者において腫瘍免疫は有効に作⽤しておらず，そのメカニズムについての解析は不⼗分である. 本研究では, CML で腫瘍免疫が働かないメカニズムを理解するために, フローサイトメーターで CML 患者と健常⼈の末梢⾎および⾻髄に含まれる免疫細胞 (特に⾻髄系細胞) およびその前駆細胞集団の解析を⾏った. また, RNA-seq を⽤いて各⾻髄系細胞の遺伝⼦発現を⽐較することで, CML 患者において腫瘍免疫が抑制される原因の⼀端を明らかにした.

2. 材料と方法
フローサイトメトリー
CML 患者および健常⼈から採取した細胞を, 各免疫細胞および前駆細胞に特異的な抗体で標識した (Breton et al., 2015; Bruck et al., 2018). PD-L1 の発現解析には抗 PD-L1 抗体を, IRF8 の発現解析には抗 IRF8 抗体を⽤いた. 標識細胞は FACS Canto II で分析し, FlowJo software で解析した. 本研究で⾏われた全ての解析は, 横浜市⽴⼤学の倫理委員会から承認されている (ヒト検体: A150723003 およびマウス細胞: #F-A-17-018 および#F-A-20-043).
RNA シークエンス (RNA-seq)
古典的 1 型樹状細胞 (cDC1), 好中球, 好塩基球, 単球の RNA から Nextera XT DNA
Sample Preparation Kit (Illumina) で cDNA を調製した. 各 cDNA は Illumina HiSeq 500 を⽤いてシークエンスした.
バイオインフォマティクス解析
上記シークエンスデータ (GSE162462) および既報データ (GSE5550, GSE44920, GSE84509, GSE89020) の遺伝⼦発現は統計ソフトの R および R のパッケージ (prcomp, edgeR, limma) を⽤いて, 発現量の算出, 主成分分析, 相関解析, 発現変動遺伝⼦の抽出, ⾮階層的クラスタリング解析を⾏った.

3. 結果
CML 患者では樹状細胞分化が早期段階から障害される
CML 患者および健常⼈の末梢⾎を, フローサイトメーターを⽤いて, 解析した. すると CML 患者で⾻髄系細胞の割合が増え, リンパ球系細胞は割合が 3 割程度に減少した. 興味深いことに, ⾻髄系細胞の中でも古典的樹状細胞 (cDC) の割合は著減した. そこで, フローサイトメーターで CML 患者と健常⼈の⾻髄における各前駆細胞の割合を調べると, CML患者では cDC 系譜の前駆細胞の割合が著しく少なかった.

CML 患者の造血幹前駆細胞 (HSPC) では IRF8 の発現が低い
CML 患者の HSPC とマウスの⾻髄前駆 (Lineage−) 細胞に BCR-ABL を遺伝⼦導⼊した細胞の発現プロファイルから，共通して発現が著減する遺伝⼦として IRF8, FLT3, DNTT 遺伝⼦を抽出した．前⼆者は cDC 分化に重要であることが知られている．さらにマウス HSPCを⽤い，BCR-ABL による cDC 分化抑制が転写因⼦ IRF8 の強制発現によって解除される⼀⽅で，サイトカイン受容体 FLT3 の強制発現にはそのような効果がないことを⾒出した．また，CML 患者の HSPC において，IRF8 タンパク質の発現が減少していることも確認した.

CML 患者の好中球では免疫抑制関連分子の発現が高い
次に, CML 患者の免疫細胞で質的な変化が起こっているのかを調べるために, CML 患者と健常⼈の cDC1, 好中球, 好塩基球, 単球の RNA-seq を⾏なった. なお cDC1 はがん抗原のクロスプレゼンテーションによって T 細胞による抗腫瘍免疫を惹起するのに必須な細胞である．CML 患者と健常⼈の遺伝⼦発現プロファイルは, cDC1, 好塩基球, 単球では⼤きな差がなかったのに対して, 好中球では⼤きく変動していた. そして, CML 患者の好中球では免疫抑制関連分⼦の発現が顕著に⾼かった.

CML 患者の単球と好塩基球では PD-L1 が高発現である
RNA-seq データをより詳細に解析をするために, 各免疫細胞集団間あるいは健常⼈と CML 患者間で遺伝⼦発現変動が⼤きい遺伝⼦を抽出して, クラスタリング解析を⾏なった.免疫関連分⼦に着⽬すると, PD-L1 が好塩基球に選択的に発現する遺伝⼦クラスターに含まれていた. そこで, フローサイトメトリーを⽤いて末梢⾎の⾻髄系細胞表⾯の PD-L1 タンパク質発現を調べると, CML 患者および健常⼈いずれにおいても好塩基球で最も発現が⾼かった. 加えて, CML 患者の単球では健常⼈の単球と⽐較すると, 細胞表⾯ PD-L1 の発現が⾼いことが明らかになった.

4. 考察
本研究結果から, CML 患者では IRF8 の発現低下によって腫瘍免疫の活性化を担う cDC1分化が阻害される⼀⽅で，免疫抑制性に働く⾻髄系細胞が増加していることが⽰された. この状況を例えると, 腫瘍免疫のアクセルが壊れるのみならず, ブレーキが踏まれている状態であると⾔えよう. 腫瘍免疫のアクセルを踏むための IFNα 療法やブレーキの解除のための抗 PD-1 抗体投与などが試みられてきたが, 効果は限られている (Zitvogel et al., 2016).その理由として, CML に対する腫瘍免疫のアクセルまたはブレーキのいずれか⼀⽅を標的にするだけでは不⼗分である可能性が考えられる. 本研究によって，腫瘍免疫のアクセルとブレーキ両側⾯を標的とする CML 治療法開発の必要性が⽰唆された.

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参考文献

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