論文の公開元へAcyl-CoA synthetase 6 regulates long-chain polyunsaturated fatty acid composition of membrane phospholipids in spermatids and supports normal spermatogenic processes in mice
概要
１．序
docosahexaenoic acid (DHA)1)やdocosapentaenoic acid (DPA)2)などの長鎖多価不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid: LC-PUFA）3)は神経組織、網膜、精巣など特定の臓器に膜リン脂質の形で他の臓器に比べ多く存在している。近年このLC-PUFA含有リン脂質自体がこれらの臓器の正常な生理機能発揮に必須であるということが明らかになりつつある[1]。
細胞内に取り込まれたLC-PUFAはLC-PUFA-CoAに代謝されて初めてLC-PUFA含有リン脂質の合成に使用される(図1)。これまでにリゾリン脂質アシル転移酵素の一種であるLpaat3がDHA―CoAを基質にDHA含有リン脂質の形成と正常な精子形成に必須であることが示されていた[2]。
一方で、Long-chain acyl-CoA synthetase(ACSL) の一種であるACSL6が in vitroでLC-PUFAを基質にすること、そして脳や精巣などLC-PUFAを多く含有する臓器に特徴的に発現していることから、 Lpaat3の上流で臓器LC-PUFA蓄積に寄与している可能性が考えられた[3]。そこで我々はこの可能性とLC-PUFA蓄積の生理学的意義を解明するためにACSL6欠損マウスを作成し表現型解析を行い、ACSL6が精巣におけるDHA/DPAの選択的な臓器蓄積と雄性生殖に必要であることを明らかにした。
２．実験方法
【1. ACSL6欠損マウスの作製】
これまでACSL6の11番エキソンにコードされるアミノ酸領域がAcsl6の酵素活性に必須である[4]。そこで、10番と11番イントロン領域のPAM配列を含む部分をそれぞれターゲットにし、 sgRNAを計２つ作成した。C57BL/6Jの受精卵の細胞質に2種のsgRNAとCas9 RNAを注入の上、メスのマウスの子宮に着床・発生させた。ジェノタイピングは２つのforward primerと１つの reverse primerを用いて行った（図2A）。野生型アレルからはforward primer 2のPCR産物(826 bp)が、ノックアウトアレルからはforward primer 1のPCR産物(1114 bp)が複製されるように PCR条件を設定し、野生型（WT）、ヘテロ（HZ）、ノックアウト（KO）マウスを区別した(図 2B)。
【2. 脂質抽出・解析】
等重量の精巣もしくは細胞をホモジネートし、メタノール: クロロホルム: 水= 2: 1: 0.2の比率の溶媒で一相抽出した。脂質解析は、四重極型MSと飛行時間型MSをタンデムに繋いだ四重極飛行時間型LC-MS/MS (ACQUITY UPLC I-Class; Waters / Triple TOF 6600; Sciex)による Information Dependent Acquisition (IDA) モードで行った。LCシステムには、逆相カラムであるACQUITY BEH C18カラム(粒子径1.7 μm)を適用し、移動相は、メタノール：アセトニトリル：水=1:1:3とイソプロパノールにそれぞれ酢酸アンモニウム 5 mM、EDTA 10 nMを添加した二液混合型グラジエントを使用し、ネガティブイオンモードおよびポジティブイオンモードで測定した。
【組織中のACS活性測定】
精巣をbuffer1 (0.25 M sucrose, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM DTT, and protease inhibitor cocktail)中でホモジネートし未破砕の細胞を除いたのちに100,000 gで遠心し総膜画分を得た。この画分1 µg protein相当を100 µLの基質を含有したbuffer2 (200 mM Tris-HCl pH 7.5, 8 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1mM NaF, 1 mg/mL BSA, 2.5 mM ATP, 0.5 mM CoA, 2.5 µM パルミチン酸, 2.5 µM アラギドン酸, 2.5 µM DPA, and 2.5 µM DHA)内で37℃, 4分反応させた。産生されたアシル-CoAは LC-MS/MS (ACQUITY UPLC I-Class; Waters / Triple Quad 6500; Sciex)のMRMモードで測定した。LCシステムには、逆相カラムであるYMC-triart (粒子径1.8 μm)を適用し、移動相はメタノール：アセトニトリル：水=1:1:3とイソプロパノールにそれぞれ酢酸アンモニウム 5 mM、 EDTA 500 nM、アンモニア 0.025%を添加した二液混合型グラジエントを使用した。MSではポジティブイオンモードでアシルCoAの脂肪酸特異的なフラグメントを用いて定量した[5]。定量には17:0-CoAを内部標準として使用した。
【3. 精巣の細胞単離・精製】
分化途中のマウス精細胞である、spermatogonia (SG)、spermatocyte (SC)、Round spermatid (RS)、Elongated spermatid (ES)4)を解析するためflowcytometer（BD FACS Aria）による細胞の単離を行った。精巣を1 mg/mL コラゲナーゼ処理の上、0.25 % trypsinと1 mg/mL DNase type Iで分解し単細胞浮遊液を作成した。単細胞浮遊液を40µm cell strainerでろ過し、2.5 µg/mL Hoechst 33342と1 µg/mL propidium iodide (PI)で染色した。細胞はBD FACS Aria flow cytometerで、PIで死細胞除去、hoechst 33342による倍数体の選別、前方・側方散乱光、さらにはhoechstのside populationを用いたゲーティングを行い単離した。
【4. 精巣上体からの精子の単離・体外受精】
ACSL6 HZもしくはKOマウス雄の精巣上体に切り込みを入れたのちに精子をピンセットで絞り出しHTF培地中で5% CO2、37℃の条件で１時間培養した。卵子を得るためにWTの雌マウスに妊馬血清性性腺刺激ホルモン8.3 IU腹腔内投与し、48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン8.3 IU腹腔内投与し過剰排卵させ、さらに15時間後に卵管を採取して得た。サンプル間で同じ濃度の精子を卵子とHTF培地で5時間培養し受精させた。受精卵は前核5)の有無で判断し、受精率を計算した。
【5. 精巣のHE染色・TUNEL染色】
マウス精巣をDavidson固定液に室温で24時間浸漬固定しパラフィン包埋した。サンプルは5 µmの厚さに薄切したのちHematoxylin-Eosin染色を行った。精巣内のアポトーシス検出のための TUNEL染色はIn Situ Cell Death Detection Kit (Sigma)のプロトコールに従って行った。
【6. 精巣のトルイジンブルー染色・電子顕微鏡】
マウスの左心室からPBSを注入し脱血し2.5% グルタルアルデヒド/0.2M リン酸緩衝液で還流固定を行った。固定組織はエポン包埋の後、4 µmの厚さに薄切したのちトルイジンブルーで染色した。電子顕微鏡に関して、グルタルアルデヒド固定した組織を2%酸化オスミウムで4℃で2時間固定した。エタノール脱水したのち、プロピレオキシド置換しエポン包埋した。包埋後、ウルトラミクロトームで0.2 µmに薄切し、０．４％酢酸ウラン、鉛で染色後に電界放出形走査電子顕微鏡（Field Emission-Scanning Electron Microscope (FESEM)）(SU8220）6)で撮影した。
3. 実験結果
【1. ACSL6 KOマウス精巣の脂質解析】
マウスをHZ同士で交配させるとWT、HZ、KOマウスがほぼメンデル比で生まれることから明らかな胎生致死は認めないにも関わらず、KOマウスの雄をWTの雌と交配させると全く子供が生まれなかった。このことからACSL6 KOマウスは雄性の不妊であることが示唆された。Acsl6は精巣に高発現していることから脂質解析を行うと、ACSL6 KOマウスの精巣ではDHA（22:6, n-3）およびDPA（22:5, n-6）含有リン脂質の有意な減少が認められた。精巣の膜たんぱく質画分を用いて組織でのAcyl-CoA合成能を評価するとKOマウスでDHA/DPA選択的にAcyl-CoA合成能の低 下を認めた。このことからAcsl6は精巣でDHA/DPA-CoA合成を介してDHA/DPA蓄積に関与することが示唆された。次に精細胞をフローサイトメーターで分離し、各分化細胞集団におけるACSL6の遺伝子発現を調べると、分化途中の精細胞であるSC, RSにおいて顕著なACSL6の発現を認めた(図3A)。単離した精細胞の脂質を測定するとACSL6 KOマウスのSC, RS, ESといった分化後期の精細胞においてDHA,DPA含有リン脂質の減少が認められた(図3B)。
【2. 表現型解析】
個体レベルの生殖能力は精子の数と個々の精子の受精能によって規定される。精子が蓄えられている精巣上体から精子を単離し精子数の定量と観察を行うと、著明な精子数の低下と異常形態をもつ精子を多く認めた(図4)。精子の受精能を評価する体外受精を行うと、コントロールと比較してKOマウスで体外受精成功率の低下を認めた。このことからACSL6 KOマウスは精子数と精子の受精能の両方の低下に起因する不妊である可能性が考えられた。
次に精巣組織の形態について詳細に解析した。まず、ACSL6 KOマウスの精巣は形状や組織重量の明らかな差をコントロールと比較して認めなかった。またフローサイトメーターを用いて各分化段階（SG, SC, RS, ES）の精細胞の割合を比べると明らかな差が検出されず、分化過程の異常は示唆されなかった。一方で、分化が終了した精細胞であるESを強く描出するトルイジンブルー染色を行うと、本来であれば放出
されているはずのESが放出され ずに管腔側に多くとどまっている ことを見出した。電子顕微鏡でES の微細構造を描出すると、KOの精 細管管腔で小胞に覆われた異常 ESの存在を多数認めた。アポトー シスを検出するTUNEL染色で染 色すると多数のKOマウスのESで TUNEL陽性となり、ESが細胞死 を起こしていることが確認された。以上のことからACSL6 KOマウスの精子形成不全の原因は精巣での精子放出の遅延とESのアポトーシスであることが示唆された。
4. 討論
長鎖脂肪酸は細胞質でACSLによってアシルCoAに変換され、リン脂質の合成に利用される（図1）。我々はACSL6 KOマウスの精巣の解析を通して、Acsl6は分化途中の精細胞でDHA/DPA含有リン脂質の蓄積に関与するとともに、正常な精子形成に必須であることを見出し今回英文誌に発表した（Shishikura K et al. FASEB J. in press.）。これまで分化過程の精細胞ではDHA-CoAからDHA含有リン脂質を合成する酵素であるLpaat3が高発現し、そのKOマウスの精巣ではDHA含有リン脂質の選択的低下と精巣での精子放出遅延と精子の形成不全を呈することから、精子形成においてn-3脂肪酸のDHA含有リン脂質が重要とされている[6]。ACSL6 KOマウスの表現型は精細胞のDHA含有リン脂質が低下するLPAAT3 KOマウスと共通する表現型を呈するものの、著明な精子数の減少とESのアポトーシスを伴うという点でより重度の表現型であった。このことはDHA含有リン脂質以外にも精子形成において重要な脂質代謝が存在する可能性を示唆している。
論文準備中に海外の別のグループより報告されたACSL6 KOマウスの脳のリピドミクス解析で はDHA含有リン脂質の選択的低下を認めていた[7]。この同一遺伝子欠損による影響が臓器によって異なる点は、脂肪酸輸送体やリゾリン脂質アシル転移酵素といったACSL6以外の脂肪酸蓄積経路に起因する可能性がある[2, 8]。また、ACSL6 KOマウスの雄性不妊の表現型については、ほぼ同時期に報告された論文においても支持されている[9]。
5. まとめ
1) ACSL6 KOマウスの精巣においてDHA/DPAに対する酵素活性の低下とDHA/DPA含有リン脂質の低下が認められた。
2) Acsl6は分化途中の精細胞（SC, RS）に高発現し、分化に伴う精細胞内へのDHAとDPAの蓄積に寄与していると考えられた。
3) ACSL6 KOマウスでは、分化が終了した段階のelongated spermatidの放出の異常と細胞死によって精子の数と受精能に異常を来たし、雄性不妊の表現型を示した。
6. 今後の研究計画
今後はACSL6 KOマウスの精巣の表現型の分子メカニズムをさらに検証していく予定である。と くにDHA/DPAがどのように精子形成に寄与しているのかを分子レベルで明らかにしていきたい。
この論文で使われている画像
