リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「Effect of density gradient centrifugation on reactive oxygen species in human semen」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

Effect of density gradient centrifugation on reactive oxygen species in human semen

竹島 徹平 横浜市立大学

2020.04.30

概要

1. 序論
　平成27年度に厚⽣労働省⼦ども・⼦育て⽀援推進調査研究事業「我が国における男性不妊に対する検査・治療に関する調査研究」が17年ぶりに⾏われ, その中で男性不妊の原因として最多が造精機能障害(82.4%)であり, その約半数が特発性, つまり原因不明であると報告された(湯村, 2016)．
　湯村らの報告によると, 特発性男性不妊症の45.7%に⾼濃度の活性酸素(reactive oxygen species: ROS)が発現していることが分かった(Yumura et al., 2017)．ROSは低濃度では受精過程において重要なcapacitation, hyperactivation, アクロソーム反応, 卵との融合に促進的に働く(de Lamirande et al., 1997; Du Plessis et al., 2015; Sharma and Agarwal, 1996; Aitken, 1997)が, ⾼濃度のROSが発現し, 精漿中の抗酸化物質との不均衡が⽣じることによって酸化ストレスが発⽣する(Agarwal, 2003)．精液中の酸化ストレスは1)脂質過酸化, 2)精⼦DNA断⽚化, 3)アポトーシスと, ⼤きく3つの有害イベントに関わっている(de Lamirande et al., 1997; Jones et al., 1979)．そのため, 精液中ROSを低減するためにさまざまな取り組みが⾏われている．今回われわれは密度勾配遠⼼法(density gradient centrifugation: DGC)により精液中ROSは除去可能か, また遠⼼を⾏うことにより発⽣するROSはどの部分に蓄積されるか, につき検証すべく実験を⾏った．

2. 対象と⽅法
　対象は2011年6⽉から2012年1⽉の間に横浜市⽴⼤学附属市⺠総合医療センター⽣殖医療センター男性不妊外来を受診した、無精⼦症患者を除く118名, 143サンプル(年齢中央値35歳, 20-55歳)であった．DGCとして, 試験管底より90%および45% SpermGrad™ (SpermRinse™で希釈)を1mlずつ重層させ, その上に射出精液1mlを重層させた．その後, 室温で300g20分間遠⼼した．遠⼼後は, 最上層の精漿を除去し, 上層のLayer1, 下層のLayer2からそれぞれ0.55mlを抽出し, SMAS™を⽤い通常の精液検査を⾏うとともに, すみやかにルミノールを⽤いた化学発光法によるROS測定を⾏った．また, ROS陽性の未洗浄サンプルに対しDGCを⾏った後にLayer2におけるROSの除去率, ROS陰性の未洗浄サンプルに対しDGCを⾏った後にLayer1またはLayer2におけるROSの発⽣率について検討を⾏った．

3. 結果
　143精液サンプルのうち, 38サンプル(26.6%)でROSが陽性であった．サンプルのROS値は, ルミノール添加後の30分間の化学発光量の積分値(mv/30min/108spermatozoa)と定義した．ROS陽性群とROS陰性群では精液量(3.72±0.19ml vs. 3.32±0.30ml), 精⼦濃度(25.89±2.59×106/ml vs. 30.20±4.54×106/ml)ともに差を認めなかったものの, 運動率は有意にROS陽性群で低下がみられた(12.96±1.60% vs. 18.15±1.75%, p<0.05)．また対数変換したROS値は精⼦運動率と有意に逆相関がみられた(p<0.05, r=-0.37)．DGC後には、下層(Layer2, pellet含む)における精⼦濃度は上層(Layer1)における精⼦濃度と⽐較し有意に低かった(4.97±0.61×106/ml vs. 14.20±1.50×106/ml; p<0.01)が, 運動率は有意に⾼かった(16.10±1.71% vs. 11.61±1.15%; p<0.01)．未洗浄精液でROS陽性であった38サンプルのうち, わずか7サンプル(18.42%)でDGC後にLayer2でROS陽性であった(つまり, ROS除去率は81.56%であった)が, 24サンプルにおいてLayer1でROS陽性であった．Layer2でROS陽性であった7サンプルのうち, 5サンプルにおいてLayer1でもROS陽性であり, Layer2のROS値はLayer1と⽐較し低値であった．DCG後は, 未洗浄精液と⽐較しLayer1におけるROS値は有意に上昇していた(205.59±164.21 vs. 157.16±109.91mV/30min/108spermatozoa, p<0.01)．ROS陰性群(n=105)においては, DGCの後に19サンプル(19.10%)でROS陽性となり, うち17サンプルでLayer1から, 残りの2サンプルはLayer1・2ともROSが検出された．

4. 考察
　本研究では, 精⼦洗浄液としてSpermGrad™を⽤いたDGCによって運動精⼦を⾮運動精⼦と選別可能であった．さらに, 運動良好精⼦を多く含むDGC後の下層(Layer2)はROS陽性率が低い(6.29%)のに対し, 不動精⼦や細胞⽚を多く含むDGC後の上層(Layer1)はROS陽性率が⽐較的⾼かった(30.07%)．特に, ROS陽性群において, Layer2におけるROSの除去率は81.57%と⾼い⼀⽅で, Layer1におけるROS陽性率は63.16%であった。Layer1および2いずれもROSが検出されなかった例では, 精漿およびLayer1との境界⾯にROSが蓄積されているものと推測された．それゆえ, 未洗浄精液でROSが陽性であった症例は, ROSの発⽣源である⽩⾎球や未熟精⼦を除去することにより, 下層におけるROSを⾼い確率で除去することが可能であった．ROS陰性群において遠⼼後のLayer2におけるROS発⽣率は18.10%であったが, ⼤半のROSがLayer1で検出されており, 下層ではROSが発⽣しにくいことが判明した．未洗浄精液と⽐較し, 下層においてROSが減弱していることから, DGCは運動精⼦をROSに暴露させにくい, ということが分かった．以上の結果より, AIHおよびARTの際に精⼦調整法として⽤いられているDGCは、運動精⼦と, 不動精⼦・⽩⾎球・細胞⽚とともにROSを分離することが可能であった．

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

Agarwal, A., Ikemoto, I. and Loughlin K.R. (1994) Relationship of sperm parameters to levels of reactive oxygen species in semen specimens. J Urol 152:107–110.

Agarwal, A., Allamaneni, S.S. and Said, T.M. (2004) Chemiluminescence technique for measuring reactive oxy- gen species. Reprod Biomed Online 9:466–468.

Ahelik, A., Mandar, R., Korrovits, P., Karits, P., Talving, E., Rosenstein, K., et al. (2015) Systemic oxidative stress could predict assisted reproductive technique outcome. J Assist Reprod Genet 32:699–704.

Aitken, R.J. and Clarkson, J.S. (1987) Cellular basis of defec- tive sperm function and its association with the genesis of ROS by human spermatozoa. J Reprod Fertil 81:459–469.

Aitken, R.J. (1997) Molecular mechanisms regulating sperm function. Mol Hum Reprod 3:169–173.

Aitken, R.J., Gordon, E., Harkiss, D., Twigg, J.P., Milne, P., Jennings, Z., et al. (1998) Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa. Biol Reprod 59:1037–1046.

Aitken, R.J. and Clarkson, J.S. (1988) Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. J Androl 9:367–376.

Aitken, R.J., Finnie, J.M., Muscio, L., Whiting, S., Connaughton, H.S., Kuczera, L., et al. (2014) Potential importance of transition metals in the induction of DNA damage by sperm preparation media. Hum Reprod 29:2136-2147.

Akashi, T., Watanabe, A., Komiya, A. and Fuse, H. (2010) Evaluation of the sperm motility analyzer system (SMAS) for the assessment of sperm quality in infertile men. Syst Biol Reprod Med 56:473–477.

Das, S., Chattopadhyay, R., Jana, S.K., Narendra, B.K., Chakraborty, C., Chakravarty, B., et al. (2008) Cut-off value of reactive oxygen species for predicting semen qual- ity and fertilization outcome. Syst Biol Reprod Med 54:47–54.

Enciso, M., Iglesias, M., Galan, I., Sarasa, J., Gosalvez, A. and Gosálvez, J. (2011) The ability of sperm selection techni- ques to remove single- or double-strand DNA damage. Asian J Androl 13:764–768.

Ford, W.C.L. (1990) The role of oxygen free radicals in the pathology of human spermatozoa: implications for IVF. In Clinical IVF Forum: Current Trends in Assisted Reproduction. eds Matson, R. and Lieberman, B.A. Manchester University Press, Manchester, UK, pp. 123–139. Gomez, E. (1996) Development of an image analysis system to monitor the retention of residual cytoplasm by human spermatozoa: correlation with biochemical markers of the cytoplasmic space, oxidative stress, and sperm function. J Androl 17:276–287.

Henkel, R.R. and Schill, W.B. (2003) Sperm Preparataion for ART. Reprod Biol Endocrinol 1:108.

Holland, M.K., Alvarez, J.G. and Storey B.T. (1982) Production of superoxide and activity of superoxide dis- mutase in rabbit epididymal spermatozoa. Biol Reprod 27:1109-1118.

Iwasaki, A. and Gagnon, C. (1992) Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients. Fertil Steril 57:409–416.

Jones, R., Mann, T. and Sherins, R.J. (1979) Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, sper- micidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma. Fertil Steril 31:531–537.

Khosrowbeygi, A. and Zarghami, N. (2007) Levels of oxida- tive stress biomarkers in seminal plasma and their rela- tionship with seminal parameters. BMC Clin Pathol 7:6.

Kodama, H., Yamaguchi, R., Fukuda, J., Kasai, H. and Tanaka, T. (1997) Increased oxidative deoxyribonucleic acid damage in the spermatozoa of infertile men. Fertil Steril 68:519–524.

Komori, K., Tsujimura, A., Ishijima, S., Tanjapatkul, P., Fujita, K., Matsuoka, Y., et al. (2006) Comparative study of Sperm Motility Analysis System and conventional microscopic semen analysis. Reprod Med Biol 5:195–200.

Koppers, A.J., Garg, M.L. and Aitken, R.J. (2010) Stimulation of mitochondrial reactive oxygen species production by unesterified, unsaturated fatty acids in defective human spermatozoa. Free Radic Biol Med 48:112–119.

Lewis, S.E.M., Sterling, E.S., Young, I.S. and Thompson, W. (1997) Comparison of individual antioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men. Fertil Steril 67:142–147.

Malvezzi, H., Sharma, R., Agarwal, A., Abuzenadah, A.M., and Abu-Elmagd, M. (2014) Sperm quality after density gradient centrifugation with three commercially available media: a controlled trial. Reprod Biol Endocrinol 12:121.

Oshio, S., Kaneko, S., Iizuka, R. and Mohri, H. (1987) Effects of gradient centrifugation on human sperm. Arch Androl 19:85–93.

Pahune, P.P., Choudhari, A.R. and Muley, P.A. (2013) The total antioxidant power of semen and its correlation with the fertility potential of human male subjects. J Clin Diagn Res 7:991–995.

Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine (2013) Definitions of infertility and recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertil Steril 99:63.

Sabanegh, E. and Agarwal, A. (2012) Male infertility. In: Campbell’s urology. ed. Wein, A. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA pp. 556–579.

Sakkas, D. (2003) Abnormal spermatozoa in the ejaculate: abortive apoptosis and faulty nuclear remodeling during spermatogenesis. Reprod Biomed Online 7:428–432.

Sakkas, D. (2013) Novel technologies for selecting the best sperm for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 99:1023-1029.

Santiso, R., Tamayo, M., Gosalvez, J., Meseguer, M., Garrido, N. and Fernández, J.L. (2010) Simultaneous determination in situ of DNA fragmentation and 9-oxoguanine in human sperm. Fertil Steril 93:314–318.

Sawyer, D.E. (2003) Analysis of gene-specific DNA damage and single-strand DNA breaks induced by pro-oxidant treatment of human spermatozoa in vitro. Mutat Res 529:21–34.

Sharma, R.K. and Agarwal, A. (1996) Reactive oxygen species and male infertility. Urology 14:835–850.

Sharma, R.K. (2001) Relationship between seminal white blood cell counts and oxidative stress in men treated at an infertility clinic. J Androl 22:575–583.

Takeshima, T., Yumura, Y., Yasuda, K., Sanjo, H., Kuroda, S., Yamanaka, H., et al. (2016) Inverse correlation between reactive oxygen species in unwashed semen and sperm motion parameters as measured by a computer-assisted semen analyzer. Asian J Androl [Epub ahead of print]. doi:10.4103/1008-682X.173933

Tremellen, K. (2008) Oxidative stress and male infertility–a clinical perspective. Hum Reprod Update 14:243–258.

World Health Organization (WHO). (2010) WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen (5th ed., pp. 21–36). Geneva, Switzerland: World Health Organization.

Yumura, Y., Iwasaki, A., Saito, K., Ogawa, T. and Hirokawa, M. (2009) Effect of reactive oxygen species in semen on the pregnancy of the infertile couples. Int J Urol 16:202–207.

Zorn, B., Vidmar, G. and Meden-Vrtovec, H. (2003) Seminal reactive oxygen species as predictors of fertilization, embryo quality and pregnancy rates after conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Int J Androl 26:279–285.

参考文献をもっと見る

全国の大学の
卒論・修論・学位論文
を
一発検索！

この論文の関連論文を見る