論文の公開元へShort-term high-fat diet intake leads to exacerbation of concanavalin A-induced liver injury through the induction of procoagulation state
概要
【緒言】
高脂肪食など食生活の欧米化、肥満者の増加に伴い、非アルコール性脂肪肝（non alcholic fatty liver disease; NAFLD）の有病率は増加している。NAFLDは非進行性の病態である単純性脂肪肝（non alcoholic fatty liver; NAFL）と非アルコール性脂肪性肝炎（non alcoholic steato hepatitis; NASH）に分類され、本邦におけるNAFLDの有病率は約30%、NASHの有病率は3～5％と推定されている（日本消化器病学会「NAFLD/NASH診療ガイドライン2014」）。特に、NASH症例では、肝臓の線維化の進行による肝硬変への進展、さらには肝細胞癌の合併のリスクがあるため、その有病率の高さは保健医療上の大きな問題となっている。
NASHの病態成立機序については、その疾患概念の提唱時よりtwo hit theoryが提唱されてきた。まず、肝細胞への脂肪沈着（first hit）が起こり、その後、肝細胞障害要因や遺伝的素因（second hit）が加わることでNASHの発症に至るという仮説である。first hitである脂肪肝の形成は、肥満や食事摂取過多による細胞への脂質輸送の増加、肝内の脂肪酸の増加、肝細胞からの脂質輸送障害などによって起こる。この時点では炎症を伴わないNAFLの状態にとどまるが、ここにsecond hitとして、何らかの原因による酸化ストレス、腸管由来のエンドトキシン、アディポサイトカインであるTNF-α、遊離脂肪酸などの複数の因子の負荷が肝臓に加わることでNASHを発症するというのがtwo hit theoryである（Gastroenterology.1998;114:842-845）。最近では、脂肪変性や炎症の進展が連続性に起きるのではなく、並行して生じてくるmultiple parallel hit theoryという仮説も提唱されているが、NASHの病態成立機序は未だに明確にされていないのが現状である（Metabolism.2016;65:1038-1348）。
一方で、肥満あるいは高脂肪食摂取が血栓症リスクを上昇させることが明らかにされている。実際にメタボリック・シンドロームでは、糖尿病、脂質異常症、高血圧などの合併によってリスクの高まる心筋梗塞や脳梗塞などの血栓形成性疾患が大きな問題となっている。また、肥満者ではアディポサイトカインであるplasminogenactivatorinhibitor-1（PAI-1）の血中濃度の上昇を認め、血栓形成性疾患の発症に関連する凝固亢進状態にあることも示されており（ThrombHaemost.2004;91:861-72.）、高脂肪食負荷による高血糖状態、過剰な脂質の代謝過程で産生され得る遊離脂肪酸、VLD、酸化型LDLが、PAI-1の発現亢進や第Ⅶ因子の活性化を惹起することも報告されている（MolCellBiochem.2003;246:69-74）。
劇症肝炎などの重症型肝炎では、肝類洞内（肝臓の毛細血管）での血栓形成による微小循環障害が肝障害の重症化をもたらすことが知られている。マウスの実験的肝炎モデルであるconcanavalin A（ConA）誘発性肝障害においては、炎症進展過程で肝臓内のtissue factor（TF）とPAI-1の発現増加が誘導され、この凝固亢進状態下で起こる肝類洞内の血栓形成、それによる微小循環の障害が、肝障害進展機序の主体であることが示されている（Hepatology.2013;57:362-72）。
これらより、肥満あるいは高脂肪食摂取による凝固亢進状態は、NASHの病態形成過程で作用する、いわゆるsecond hitに起因する肝障害への感受性上昇をもたらし、肝障害の進展に関与している可能性があると考えられる。本研究では、肝脂肪変性と同時に炎症・線維化も進展するというmultiple parallel hits theoryの立場から、高脂肪食負荷自体が肝障害の増悪に関与することを明らかにし、その機序を解析することによって、NASH病態の成立機序に関する考察を試みた。
本研究は、マウスConcanavalinA（ConA）肝障害モデルを用いて、高脂肪食負荷が肝障害の重症度に与える影響を検証し、さらには肝障害重症化に関わる因子および重症化機序を解明することを目的として行った。
【材料と方法】
従来実施されてきた実験系のように長期間の高脂肪食（HFD）給餌により、完成した脂肪肝の状態に至ったマウスを用いるのではなく、肝細胞に明らかな脂肪沈着を認めない程度の短期間（2週間以内）のHFD給餌を行ったマウスを用いて実験を行った。まず、通常食（ND）摂取マウス（ND群）を対照として、HFD摂取マウス（HFD群、給餌期間：4日間、14日間）において血清AST/ALT値など血液生化学検査値、肝組織像などを評価した。また、肝臓における免疫・凝固応答関連因子、小胞体(ER)ストレス因子、解糖系関連因子および低酸素・酸化ストレス関連因子などのmRNA発現の程度をreal-timePCRにより解析した。さらに、ND群及びHFD群（給餌期間：4日間、14日間）において、ConA投与（10mg/kgi.v.）により肝障害を誘発し、肝障害のピークとなるConA投与24時間後に、血清AST/ALT値など血液生化学検査値、肝組織像などを評価した。そして、ND群及びHFD群（給餌期間：４日間）のConA投与後1時間、3時間の血清生化学検査値、肝臓における免疫・凝固応答関連因子、小胞体(ER)ストレス因子、解糖系関連因子および低酸素・酸化ストレス関連因子のmRNA発現の程度をreal-timePCRにより解析した。最後に、ND群及びHFD群（給餌期間：４日間）のConA投与30分前に抗凝固剤であるヘパリンを投与し、ConA投与24時間後に血清AST/ALT値など血液生化学検査値、肝組織像などを評価した。また、肝臓における免疫・凝固応答関連因子、小胞体(ER)ストレス因子、解糖系関連因子および低酸素・酸化ストレス関連因子などのmRNA発現の程度をreal-timePCRにより解析した。
【結果】
ND群、HFD群ともに、ConA投与前のAST/ALT値に明らかな差は認めなかった。HFD群では、血清コレステロール値、血糖値の上昇を認めたが、中性脂肪値は明らかな変化を認めなかった。肝組織像では、HFD群においても肝細胞に明らかな変性所見は認めず、OilRedOによる脂肪染色の結果からも微細な脂肪沈着を疑う所見のみが認められた。フィブリノーゲン/フィブリンの免疫染色の結果より、HFD群のマウス肝臓類洞にフィブリノーゲン/フィブリンの広範な沈着を示したが、NDマウスでは観察されなかった。また、real-timePCRの結果より、短期のHFD摂取によりIFN-γやIL-10,TNF-αやMCP-1の炎症性サイトカイン・ケモカイン、TFやPAI-1などの凝固関連因子の発現亢進も観察された。また、解糖系関連因子であるPDK-4の発現減少も観察された。
ConA投与24時間後の血清ALT値は、ND群ではALT300U/L台程度と軽度の上昇にとどまったが、HFD群においてはALT3,000-4,000U/L台とND群に比較し顕著に上昇していた。また、HFD群において給餌期間を4、14日間と変えた場合も、AST/ALT値の上昇の程度にはほとんど差を認めなかった。肝組織像においても、ALT値の上昇の程度と一致して、HFD群で壊死巣の明らかな拡大を認めた。
ND群、HFD群（給餌期間：4日間）におけるConA投与後のreal-timePCRの結果より、IFN-γ、MCP-1は、ConA投与後もHFD群において高値で推移する傾向を認めた。IL-10は、ConA投与前には両群間で明らかな差を認めなかったが、ConA投与後は、HFD群よりND群において高値で推移する傾向を認めた。TFは、ConA投与前よりHFD群で高値を示し、ConA投与後でもHFD群において高値で推移する傾向を認めた。
ヘパリンによる治療実験においては、ND群では、ConA投与の24時間後のALTレベルは、ヘパリン非処理マウス（434±175U/l）と比較してヘパリン処理マウス（36±9U/l）で有意に減少した。同様にHFD群でも、ヘパリン非処理マウス（5934±2706U/l）と比較して、ヘパリン処理マウス（112±78U/l）でALT値が有意に減少した。ヘパリン処理マウスにおけるConA投与後24時間のALT値は、ND群よりもHFD群で高い傾向にあった。
【考察】
本研究では、明らかな脂肪肝の合併をもたらさない短期間のHFD負荷によっても、肝障害の増悪が誘発され得ることを短期HFD摂食マウスモデルにおいて明らかにした。
肝組織中のサイトカイン・ケモカインmRNA発現の解析では、HFD群においてIFN-γ、TNF-α、MCP-1の発現上昇を認め、HFD負荷が肝臓内で何らかの炎症応答を惹起していることを示していた。また、HFD負荷は、TFのmRNA発現の軽度の増加と、類洞内のフィブリノーゲン沈着の増加をもたらすなど、凝固亢進状態を惹起していることも示された。そして、解糖系酵素であるHK-4、GPI-1の発現上昇、エネルギー代謝関連酵素であるPDK4の発現減少は解糖系および好気性代謝の亢進を示唆し、これがミトコンドリア電子伝達系でのROSの産生を誘発することで炎症状態を惹起する可能性も考えられた。
本研究で用いたConA肝障害モデルは、ConA投与によって刺激されたT細胞から産生されるIFN-γがTF発現レベルを上昇させ、同様に活性化されたT細胞などからのTNF-αがTFやPAI-1発現の増加に作用することで凝固亢進状態が引き起こされ、類洞内血栓形成による微小循環障害が広範肝壊死をきたすとされる急性肝障害モデルである（Hepatology.2013;57:362-72）。今回の検討ではConA投与後にTFとPAI-1のmRNA発現の増加を認めたが、その程度はHFDを負荷したマウスにおいてより顕著となった。HFD摂取で上昇する飽和脂肪酸は、細胞間接着分子ICAM-1や血管細胞接着分子VCAM-1などの炎症誘発性接着分子の発現増加を誘発することが報告されており（CurrOpininPhysiol12(2019)44–50.）、また、6〜10週間のコリン欠乏アミノ酸HFDは、フィブリノーゲンのリガンドであるインテグリンα5β1の発現を高めることが報告されている（HepatolCommun3(2018)246–261.）。これらより、HFD摂取による類洞内のフィブリノーゲン沈着の増加は、血管内の接着因子の増加やフィブリノーゲンリガンドの発現増加による可能性があり、HFD負荷による肝障害の重症化が、フィブリノーゲンの発現増加を含めた凝固亢進状態によってもたらされたことは明らかであると考えた。
本研究におけるConA刺激を、NASH病態の成立に関わるいわゆるsecond hitと捉えれば、高脂肪食自体が肝臓における炎症刺激への感受性を増強することでNASHへの進展リスクをもたらしていると考えられる。実際のNASHでは、高血糖状態、遊離脂肪酸の増加、腸内細菌叢の変化とそれによる炎症誘発性菌体成分の増加、肝細胞に傷害性に作用する二次胆汁酸の上昇（Nature.2013;499:97-101）などがsecond hitの候補と考えられているため、より生理的な刺激（second hit）により、同様の病態が再現できることを示す必要があり、この点については、さらに検討を要するものと考えられる。
食餌因子が直接NASH病態の成立に関わるという仮説は、食の欧米化（高脂肪食）による脂肪肝の増加、血栓症リスクの増加などの臨床的事象とも矛盾せずにmultiple parallel hit theoryを説明できる可能性がある。食餌という生活習慣からNASH病態の成立を説明できる可能性のあるモデルとして、今後も検討を進めていきたい。
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