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膜透過性ペプチド修飾によるエクソソームの細胞内移行促進技術の開発

野口 公輔 大阪府立大学 DOI:info:doi/10.24729/00016947

2020.07.07

概要

エクソソームはmicroRNA や酵素等を搭載した直径約 30-200 nm の脂質二重膜で覆われた小胞で、多胞性エンドソーム（multivesicular body, MVB）で形成された後に細胞外へと分泌され、他の細胞に移行することで細胞間情報伝達における重要な役割を担っている[1-4]。そのエクソソームは血液や尿、唾液などの様々な体液にも含まれ、血液 1 µL 中に約 300 万個のエクソソームが含まれていることが知られており、エクソソームの分泌量、及び、エクソソームに内包された機能性分子の種類や発現量は細胞の周辺環境や細胞種によって異なることが明らかとされている[3-6]。したがって、患者の血液や尿などの体液からエクソソームを単離し、そのエクソソームに内包された分子を解析することで、患者にとって低侵襲で、且つ、早期に疾患の診断を可能にする技術開発が行われている[3, 4, 7, 8]。一方で近年、エクソソームは細胞毒性が無く（自己エクソソーム）、免疫制御が可能、人工的に機能性分子の修飾、及び、内包が可能等、薬学的な観点から高い優位性をもつことから、次世代の薬物送達ツールとしても高く注目されている[9, 10]。さらに、免疫原性の課題を克服するために、患者の体液から採取したエクソソームに患者が必要とする治療薬を内包し、患者に戻すといったテーラーメード治療が究極の目標として掲げられる（Figure 1）。しかし、エクソソームの細胞内移行性の低さが、エクソソームを薬物送達ツールとして応用する上で、改善すべき重要課題とされている。その課題に対して、著者の所属研究室では、がんに過剰発現している上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor (EGFR)）や KRAS 変異体の発現によって誘導されるマクロピノサイトーシス[11-14]がエクソソームの細胞内移行において重要であることを報告している[15]。さらに他のグループによって、KRAS 変異体を発現したヒト膵臓がん細胞に対して、エクソソームがマクロピノサイトーシスを介して効率的に細胞内へと移行し、エクソソームの中に人工的に内包した siRNA の活性を顕著に発揮させ、リポソームを用いた同様の実験よりも高い腫瘍増殖抑制効果を示すことも報告されていることから、エクソソームを基盤とした細胞内薬物送達におけるマクロピノサイトーシスの重要性が認められている[16]。

一方で、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus (HIV)）-1 Tat タンパク質由来ペプチド Tat (48-60) やオリゴアルギニン ((Arg)n (Rn と表記)：n = 8~12)に代表 されるアルギニンペプチド[17]は、形質膜上に発現するプロテオグリカンや、ケモカイ ン受容体 CXCR4 を介してマクロピノサイトーシスを誘導することが知られている[17- 21]。そこで、第 1 章では、アルギニンペプチドをエクソソーム膜に二価性リンカーを 介して化学修飾し、エクソソーム自体にマクロピノサイトーシスを誘導させることで、エクソソームの細胞内移行効率を増強させることを目的とした研究を展開した。そして、アルギニンペプチドのエクソソーム膜への修飾が、エクソソームの細胞内移行、及び、マクロピノサイトーシス誘導、内包薬物のサイトゾル送達効率に与える影響について得 られた結果を示す。さらに、アルギニンペプチド単体の性質として、配列中のアルギニン残基数が、細胞内移行やマクロピノサイトーシス誘導効率等に影響を与えることが知られていることから[22]、修飾したペプチド配列中のアルギニン残基数が、エクソソームの細胞内薬物送達能に与える影響についても示した。

第 2 章では、将来的にエクソソームを製剤化する上で課題となっているエクソソームの保存性向上に焦点を当てた研究を展開した。近年、凍結融解の繰り返しがエクソソームの生理的機能や物理化学的性質に影響を与えることから、エクソソームの新たな長期保存方法として、凍結乾燥技術が注目されている[23-25]。上記にも記載したように、エクソソームの性質は健康状態や細胞の状態によって変化するが[3-5]、長期保存が可能となれば、同じ性質のエクソソームを大量に貯蔵することができ、治療の安全性や利便性の向上、さらには持続的な治療が可能になる等の期待がされる。そこで第 2 章では、凍結乾燥が第 1 章で示したアルギニンペプチド修飾型エクソソームの細胞内移行や内包薬物のサイトゾル送達効率に与える影響について検討を行った結果を示す。

第 3 章では、ペプチド修飾型エクソソームを基盤としたドラッグデリバリーシステム（Drug Delivery System (DDS)）における細胞標的性の向上や低濃度のペプチド修飾で効率的にエクソソームの細胞内移行を促進させることを目的とした研究を展開した。そこで、ヒト乳がん細胞（MCF-7）に対して高い細胞内移行性を示し、抗菌タンパク質 CAP18の C 末端配列由来で、塩基性アミノ酸を配列中に多く含む細胞膜透過性ペプチド、sC18に着目した。このsC18 は二量体型構造（(sC18)2）にすることで、細胞内移行性がsC18と比較して低濃度で顕著に上昇することも報告されている[26, 27]。さらに、これらペプチドの細胞内移行機序についてはこれまで不明であったが、sC18 と同様に HIV-1 由来の Tat (48-60) やオリゴアルギニンなどの塩基性アミノ酸を豊富に含む配列を有する細胞膜透過性ペプチドは、エクソソームの細胞内移行においても重要なマクロピノサイトーシスを誘導することから[17-21, 28]、sC18、及び、 (sC18)2 がマクロピノサイトーシス誘導能を有する可能性が考えられた。そこで第 3 章の前半部分では、sC18、及び、(sC18)2の細胞内移行におけるマクロピノサイトーシスの寄与について検討した結果を示す。さらに後半部分では、その前半部分で示した結果をもとに、それらペプチドをエクソソーム膜に化学修飾した際の、ペプチド修飾、及び、修飾されたペプチドの構造がエクソソームの細胞内移行やマクロピノサイトーシス誘導、内包薬物のサイトゾル送達に与える影響について示した結果を説明する。

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