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ブドウ樹内マイクロバイオームの解析および有用樹内共生菌による植物病害防除の可能性

濵岡 一弘 山梨大学 DOI:info:doi/10.34429/00005148

2022.03.18

概要

ワインの原料となる醸造用ブドウは栽培地によって同じ品種でも果実品質が異なるため栽培地の個性がワインの個性として表現される。これまでに栽培環境(気候条件、土壌条件など)と果実成分変化との相関関係に関する研究が数多く行われてきた。近年ではブドウ畑の土壌、根圏および葉圏に生息する微生物のマイクロバイオーム(微生物叢)と果実品質との相関関係を明らかにする研究が盛んである。一方、植物に内生する共生微生物の中には宿主である植物の成長を助長し、病原菌に対する抵抗性を付与する共生微生物も発見されており、植物と共生微生物の相互作用による植物の特性変化に研究対象が移行している。ブドウ樹内に生息する共生微生物はブドウ樹との特異性・親和性が高いと予想されることから、ブドウ樹内に生息するマイクロバイオーム(以下、樹内マイクロバイオーム)の解析は、ブドウ樹を真に理解し、果実品質の向上を考える上で重要である。

本学位論文の目的は、日本で栽培されている醸造用ブドウにおいて「ブドウ品種により樹内マイクロバイオームが異なるのか」、「同じ品種でも栽培地が異なると樹内マイクロバイオームは異なるのか」および「樹内マイクロバイオームは季節によって変動するのか」という疑問を検証することである。加えて、樹内マイクロバイオームのうち培養可能な有用共生菌を用いた植物病害防除の可能性についても検討した。

日本のブドウ栽培地11か所から甲州、シャルドネ、ピノ・ノワールおよびカベルネ・ソーヴィニヨンの新梢成長期およびベレーゾン期の新梢を採取し、次世代シーケンサーを用いて樹内マイクロバイオームを解析した。いずれの新梢からも真菌類はほぼ検出されなかったため、本学位論文では新梢に共生する細菌叢を綱レベルで解析した。総リード数は7,019,600(試料当たり46,642~285,003)、配列の類似性が97%以上の配列を1つのOTU(Operational Taxonomic Unit)とし、希薄化後のOTU数は1,305であった。季節間の比較により、品種に関わらず、新梢成長期でgamma proteobacteria、ベレーゾン期でAlpha proteobacteriaおよびOx photobacteriaの存在割合が高く、その他にActinobacteria、Bacteroidia、BacilliおよびClostridiaが醸造用ブドウの樹内マイクロバイオームを形成していた。品種間の比較により、甲州およびピノ・ノワールはいずれの栽培地でも類似した細菌叢を示した。一方、シャルドネおよびカベルネ・ソーヴィニヨンは栽培地が異なると細菌叢に変化が認められた。

醸造用ブドウの樹内マイクロバイオームの多様性を示すため、OTU数、Chao1指数およびShannon指数を用いたα多様性解析を実施したところ、それぞれの指標とも季節間および栽培地間による樹内マイクロバイオームの差は認められたが、品種間による差は検出されなかった。一方、距離が近いほど試料間の類似度が近くなるWeighted Uni Frac距離を指標としたβ多様性解析では、新梢成長期では甲州およびピノ・ノワール間の距離が、ベレーゾン期では4品種とも距離が近くなった。試料が類似していると距離が近づく多次元尺度解法(Multi-Dimensional Scaling)では、甲州は他の3品種より離れた位置に存在することが明らかとなった。同一栽培地の品種間比較では、新梢成長期で4品種の位置が離れていたが、ベレーゾン期になると近づいた。栽培地間の比較では、甲州は新梢成長期およびベレーゾン期ともに栽培地間の距離が近く、一方でシャルドネおよびカベルネ・ソーヴィニヨンは季節に関わらず各栽培地の距離が広く離れていた。以上の結果から、①品種により樹内マイクロバイオームは異なること、②同じ品種でも栽培地間で樹内マイクロバイオームが異なる場合があること、③樹内マイクロバイオームは季節変動し、新梢成長期で多様性が高いこと、が示唆された。

次に、山梨大学ワイン科学研究センター圃場で栽培されているブドウ品種の新梢木部から樹内共生菌を247株分離した。そのうち15株がブドウ灰色かび病菌(Botrytiscinerea)に拮抗性を示した。さらに甲州から得たKOF112は、ブドウ晩腐病菌(Colletotrichumgloeosporioides)およびブドウべと病菌(Plasmoparaviticola)の代わりに供試した卵菌類であるジャガイモ疫病菌(Phytophthorainfestans)に対しても拮抗性を示した。顕微鏡観察によりKOF112は、いずれの病原菌の菌糸も膨張あるいは破裂させることでそれらの菌糸成長を阻害することが明らかとなった。KOF112の16SrDNA遺伝子配列はBacillusvelezensisFZB42に近縁であることから、KOF112はB.velezensisに属する菌株であると判断した。KOF112は、3,916,789bpの環状ゲノムと13,003bpのプラスミドを持っており、3,746個のコード遺伝子、27個のrRNAおよび86個のtRNAを有していると予測された。非リボソーム合成の抗菌ペプチドやポリケチドを担う遺伝子群の解析において、KOF112はサーファクチン、バシリバクチン、バシリシン、バシレンの生合成を担う遺伝子群を有するが、イツリン、バシロマイシン、フェンギシン、ディフィシン、マクロラクチンの生合成を担う遺伝子群を持たないことが明らかとなった。共生微生物は植物との親和性が高いと考えるのが妥当である。KOF112がブドウ樹上あるいは内に強固にコロニー形成することができれば、一般的に植物上での寿命が短いとされる市販の生物防除剤に比べKOF112は病害防除活性の長期的効果という優位性を持つであろう。

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参考文献

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