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Liver ductal organoids reconstruct intrahepatic biliary trees in decellularized liver grafts

Tomofuji, Katsuhiro 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k24198

2022.09.26

概要

肝移植は末期肝不全に対する唯一の根本治療であるが、ドナー肝臓不足は現状でも解決できていない課題であるため、人工肝臓をはじめとした代替治療が模索されている。本研究で用いるBio-engineered liverは、肝臓を脱細胞化した細胞外マトリックスに新たな細胞リソースを生着（再細胞化）させる技術で、移植可能な生体人工肝臓グラフトとして期待されている。しかし、再細胞化後の脈管構築や適正な細胞配置の実現に課題があり、特に胆管の再細胞化は、胆管上皮細胞の初代培養が技術的に困難なこともあり充分検討されてこなかった。近年、三次元オルガノイド培養技術が発展する中で、肝組織由来胆管系オルガノイド（liver ductal organoid：LDO）は、調製に遺伝子操作を要さず、かつ高い増殖能を持つことを特徴とした培養系として注目されている。本研究では、ラット脱細胞化肝臓グラフトを胆管構築させる細胞リソースとして、マウスやヒトLDOの有用性を検証した。

まずマウスLDOをinvitroで培養し、胆管上皮細胞としての性質を検証した。マウスLDOは、肝外胆管組織と同程度に胆管マーカー（Krt19,Sox9,Cftr）を発現している一方で、肝細胞マーカー（Alb,Hnf4a,Cyp3a11）は肝細胞に比べて非常に低い発現であった。このことから、LDOは培養環境では胆管の特徴を強く保持していることがわかった。さらに、LDOでは代表的な輸送タンパクであるmultidrug resistance protein 1 （MDR1） とcystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR）が発現し機能していた。脱細胞化組織については、ラットから肝臓を摘出後、48時間かけて脱細胞化を行い、全ての細胞成分を除去した。この脱細胞化肝臓の肝内胆管にLDOを総胆管経由で注入し、exvivo循環培養システムを用いて2〜5日間培養を行った。LDOが生着した再細胞化胆管は、本来の肝内胆管に類似した樹枝状構造を呈し、かつ、内部は管腔構造を形成しており、胆管マーカー（Krt19,Sox9,Cftr）の発現も維持されていた。また、全胆管の40〜60%程度が再構築されていることも確認した。さらに肝細胞との共培養が可能であるかを確認するため、まず脱細胞化肝の胆管をマウスLDOで再細胞化して5日間循環培養し、次にマウス初代肝細胞を総胆管経由で注入し肝実質を再細胞化した。共細胞化した組織では、再細胞化胆管は細胞生着が維持され、注入された初代肝細胞も主に肝実質腔に生着していることが確認された。また、LDOで再細胞化された胆管と肝細胞で充填された肝実質は、それぞれ胆管マーカーと肝細胞マーカーの特異的な発現を維持していた。さらにこれらを踏まえ、ヒト由来LDOでも同様に再細胞化胆管が構築可能であることを示した。

これらの結果から、LDOはラット脱細胞化肝臓の肝内胆管構築に有用であることを示した。これまで脱細胞化肝臓の胆管細胞リソースとして初代培養の胆管細胞と人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来胆管細胞が報告されているが、LDOのように肝内胆管を広範囲に裏打ちし、かつ、管腔構造を維持できることは示されてこなかった。本手法では、高い増殖能を維持したLDOを脱細胞化肝の胆管構造に再細胞化することによって、管腔構造を維持しながら末梢にまで生着することで、肝内胆管の樹枝状構造の構築を可能とした。移植可能な生体人工肝臓の実現に向けて、新たな胆管細胞リソースとしての利用が期待される。

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