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MYCL promotes iPSC-like colony formation via MYC Box 0 and 2 domains

Akifuji, Chiaki 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23817

2022.03.23

概要

ヒト人工多能性幹細胞(hiPS 細胞)は体細胞から樹立され、三胚葉系の細胞へと分化することができる。hiPS 細胞はヒト胚性幹細胞(hES 細胞)と同等の機能を有するが、受精卵の胚盤胞の一部である内部細胞塊の取り出しが必要なく、運用面でのメリットがあるため再生医療への応用が期待されている。hiPS 細胞の樹立はOCT3/4、SOX2、KLF4、及びc-MYC の 4 つの遺伝子を体細胞に導入し初期化を誘導することで初めて成し遂げられた。以来、いくつもの新たな初期化手法が開発されているが、現状の方法ではコストが高く、hiPS 細胞の製造は技術的に難しい。また、hiPS 細胞のクローン間の分化能の幅広い差はhiPS 細胞の応用化をより難しくしている。

ヒトの MYC ファミリー遺伝子はがん遺伝子として知られており、c-MYC、MYCN、及びMYCL が報告されている。c-MYC は高い形質転換活性を示し、腫瘍化を引き起こす可能性があるため、c-MYC を用いた初期化は臨床用のiPS 細胞の作製に不向きと考えられる。しかし、c-MYC を使わない場合の初期化の効率は極めて低い。c-MYC の代替として初期化誘導時に MYCL を用いた場合、iPS 細胞のコロニー数が増加し、三胚葉系の細胞への分化能も維持される。さらに、MYCL 由来の iPS 細胞を移植したキメラマウスでは腫瘍化による致死がほぼ起こらないのに対し、c-MYC 由来のiPS 細胞を移植したキメラマウスでは2 年間の経過観察中で50%以上が腫瘍化によって死亡した。MYCL を使うことで、c-MYC よりも効率よく質の良いiPS 細胞が作製できるということは明らかにされたが、その機能及び c-MYC と MYCL で初期化促進に違いが生じる機構については分かっていない。

MYC タンパク質は6 つのMYC Box(MB)ドメイン、MB0、1、2、3a、3b、4 をN 末端領域に持ち、bHLHLZ ドメインを C 末端領域に持つ。MYCL は MB3a ドメインを持たない。c-MYC 及び MYCL の C 末端領域は DNA との結合に必要な MAX タンパク質と結合するため初期化に不可欠である。N 末端領域はトランス活性化ドメイン(TAD)として知られ、標的遺伝子の発現制御に重要であると言われている。N 末端領域を欠損させたc-MYC の変異体は低い形質転換活性を示し初期化を促進することがわかっているが、初期化での詳しい機能については不明である。

そこで、本研究では、N 末端領域のどのドメインが重要であるかを明らかにし、プロテオーム解析によってその機能に関する新たな知見を獲得した。まず、MYCL がc-MYC よりも効率的に多くのiPS 細胞様コロニーを形成すること、及びc-MYC では非iPS 細胞様コロニーが形成されることを明らかにした。次に、MYC タンパク質のドメイン欠損型変異体を用いてMB0 及びMB2 ドメインがMYC の初期化に重要であり、MB0 ドメインの機能がc-MYC とMYCL で違うことを明らかにした。また、プロテオーム解析を行い、MB0ドメインの働きによって細胞接着関連因子の発現上昇が起こることを明らかにした。さらに、MYCL のMB2 ドメインの96 番目のアミノ酸部位が初期化に重要であることを同定するとともに、部分的な組み換えタンパク質を用いたアフィニティーカラム精製によって同部位での結合タンパク質を同定し、MYCL はMB2 ドメインを介してRNA 結合タンパク質(RBP)と相互作用することを明らかにした。さらに、MYCL のMB0 ドメインが翻訳後修飾を受けると考えられる結果を獲得した。

以上の結果から、MYCL は細胞接着関連因子の発現制御、及び RNA プロセッシングに関与することでc-MYC に比べて効率良く初期化を促進する可能性を明らかにした。さらに、 MYCL による初期化の促進にはそれらの機能を通して、初期化に重要とされている間葉―上皮転換の制御に影響を与えている可能性が示唆された。

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