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High-throughput screeningにおける高質な医薬品候補化合物選抜のための生物物理評価に関する研究

判谷, 理恵 筑波大学 DOI:10.15068/0002000851

2021.08.02

概要

現在の創薬活動において，様々な細胞外あるいは細胞内の分子ターゲットに対して，多種類の化合物ライブラリーをスクリーニングする high-throughput screening (HTS) は創薬の重要な手段となっている（図1-1）。

最近，コンビナトリアル合成や，天然物単離の自動化技術の発達，また，化合物ライブラリーの市販によって，多くの製薬会社が保有する化合物は数十万から100万化合物にまで増大し，化合物構造の多様性も高まっている。一方，ヒトや微生物，ウイルス等のゲノムの塩基配列解析により，数千の新規分子ターゲットが明らかとなり，過去20 年ほどの間に創薬プロセスが変化している。微量化やロボットの利用により，化合物のスクリーニングがハイスループットやウルトラハイスループットで実施できるようになり，現在では 1 日に 1 万から 10万データポイントのデータを取得できるようになっている（図1-2）。

リード化合物（創薬標的タンパク質に対して高活性を示す医薬品候補化合物）を創出するには時間，コスト，質の3 つの要素が重要である1。HTS では多数のサンプルをアッセイするため，1 ウェル当たりの測定時間が重要なパラメーターとなる。これにより 1 日当たりの化合物評価数や 1 年に実施できるHTS の数が決まる。近年，アッセイの自動化や測定の高速化によって，スクリーニングにかかる期間は短縮される一方で，アッセイ系構築やデータの解釈に時間を要する傾向にある。化合物が原因の偽陽性を排除するためには，異なる複数のアッセイを実施する必要がある。

20 年前の第 1 期のHTS では，主として天然の生成物や抽出物のスクリーニングが行われた2。1990 年代初めから半ばまでは，ターゲットの数も化合物の数も限られており，多くの製薬会社が96 ウェルプレートを用いて5 万から35 万程度の化合物ライブラリーをスクリーニングした（図 1-3）。アッセイ系構築とスクリーニング，その後のフォローアップまで，全て同じフォーマットで化合物評価が行われ，大掛かりな自動化はなされず，HTS を専門に実施するグループも存在しなかった。

その後，主要な企業で化合物ライブラリーは 100 万化合物を超えるようになり，またターゲット数も増えたため，アッセイの微量化やスクリーニングの自動化が行われるようになった。標識した材料や組換え細胞株を用いたスクリーニングが実施され，ツール作製やアッセイ系構築がスクリーニング過程の多くを占めるようになった（図1-3，HTS 第2 期）。アッセイ系に干渉する偽陽性化合物を除くため，カウンタースクリーニングが実施されるようになり，ターゲット以外の分子に対する作用を調べるため，選択性試験が行われるようになった。標識体のようなツールの作製とアッセイ系構築に力が注がれる一方で，選抜した化合物の質に着目することで，ヒット選抜以降の創薬活動（hit to lead やリード最適化の段階）（図1-1）の成功率が高まるよう工夫している。

現在のHTS ではプロジェクトに応じた手法が採られている。1 つの標的分子に対して100 万化合物以上の全化合物をスクリーニングするプロジェクトや，ツール作成からhit to lead の段階までをHTS グループが担うプロジェクトがある（図1-3， HTS 第3 期）。最新のスクリーニング技術の中には，求める作用機序の化合物を取得する精度はあっても，高コストや低スループットのものもあるため，全ライブラリーでなく，フォーカストライブラリーをスクリーニングするプロジェクトもある。しかしこれを実施するには，化合物あるいは標的分子の構造に基づいたコンピューター予測により，サブライブラリーの化合物を精度良く選抜する必要がある。フォーカストライブラリーを用いると試薬代は節約されるが，化合物プレートの作成に時間がかかるため，プロジェクトの状況に応じて使用を判断する。良質なヒット化合物が一定数得られるまで，フォーカストライブラリーのスクリーニングを繰り返す方法もある。

HTS のスクリーニングヒット化合物には，合成展開しても阻害活性を向上できず，標的以外のタンパク質も阻害する化合物が含まれてしまう。ヒット化合物選抜過程において，特に重要なのはpromiscuous binder 3 の識別である。化合物の中には特定のpH,温度，バッファー条件において，水溶液中でコロイド状態の凝集体を形成し，ターゲット分子の活性を阻害するものがある。これらの化合物の干渉は，カウンタースクリーニングによって排除し易い自家蛍光化合物の干渉とは異なる。凝集化合物は，種類の異なるタンパク質を幅広く，そして強く阻害し，本来選抜すべきやや弱いながらも分子認識する化合物を埋没させてしまう4, 5。これらの干渉は，生化学 アッセイ以外に細胞アッセイにおいても問題となることが知られている。 Promiscuous binder の作用は，化合物およびタンパク質の性質とアッセイ条件に依存 して起こるため対処が難しい。そのため標的分子に対する化合物の結合を量論的に測定できるSPR やITC のような手法，その他，nuclear magnetic resonance (NMR)や thermal shift assay (TSA), microscale thermophoresis (MST), mass spectrometry を用いたバリデーションスクリーニングが推奨される（表 1-1）。1 次スクリーニングとは別の方法で，化合物が単量体でターゲット分子に特異的に結合することを確認することが重要である。リード創生部門の専門知識と経験が，特異性の高い化合物のヒ ット選抜を確実なものとする。ヒット化合物のバリデーションに重きを置いて，適切なリード探索ストラテジーを考案することが HTS キャンペーンの成功の鍵となる。

生物物理技術の中で，SPR 法はサンプル消費量が少なくスループットが高いため，化合物評価によく用いられる。方法は，標的タンパク質をセンサー表面に固定し，化合物溶液を添加する 6。タンパク質に化合物が結合すると，センサー表面近傍の屈折率が変化して，リアルタイムに検出できる（図 1-4）。化合物の添加が終わる とランニングバッファーが流れ，タンパク質からの化合物の解離が観測される。 SPR 法は 1990 年代にバイオセンサーとして実用化が始まり，主として低分子化合物とタンパク質の親和性の決定に用いられている 7。他方，ターゲットタンパク質に対する結合比や，結合の可逆性，高濃度における結合挙動の変化についての情報も得られるため8，生化学スクリーニングのヒット化合物をSPR 評価すると，その阻害が特異的かどうかの情報を得ることができる（図1-5）。この結果からhit to lead のステージに進めるべき化合物を決定する。

また，年々創薬の難易度が高まる中で，より選択性の高い化合物を取得するためにターゲット分子の構造に着目した評価を行う等の工夫が求められる。代表的な構造変化検出技術には蛍光バイオセンサー法，second-harmonic generation (SHG), hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS), NMR，X 線結晶構造解析がある（図1-6）。蛍光バイオセンサー法やSHG は，スループットは比較的高いが情報量は少ない。一方，HDX-MS，NMR，X 線結晶構造解析は，スループットは低いが情報量は比較的多い特徴がある。蛍光バイオセンサー法は，環境変化を感知する蛍光団でタンパク質を標識し，化合物によって誘起されるタンパク質の構造変化を検出する（図1-7）9-12。測定機は広く普及している蛍光プレートリーダーを用いるため，比較的簡便に行える。SHG アッセイは蛍光標識したタンパク質を固定化し，蛍光分子の角度変化を測定することでタンパク質の構造変化を検出する方法（図 1-8）13-15 であり，化合物の自家蛍光の影響を受けにくい利点があるが，測定には専用機が必要となる。

これまでに述べたSPR 結合評価系や構造変化検出系をHTS フローに組み込むことは，高質な医薬品候補化合物の効率的な探索に有用と考えられる。本研究においては，phospholipid transfer protein (PLTP) およびinterleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) に対するHTS キャンペーンの中でこれらの評価を行った。

PLTP については，これまでHTS の報告はなく，高質な医薬品候補化合物を見出すため，通常 HTS では用いない血漿を酵素源として用い，スクリーニングを実施した。血漿中には複数のタンパク質が存在するため，ターゲットに対するヒット化合物の特異的な結合の確認は重要と考えられた。そこで新たに SPR 評価系を確立し，陽性対照化合物とスクリーニングヒット化合物のcompound 1 および2 が精製 PLTP に1:1 結合することを明らかにした。本実験は第一章で記載する。

ITK は選択性取得が困難なキナーゼであり，スクリーニングの1 次ヒット化合物の中から，キナーゼを不活性型に安定化する高質な医薬品候補化合物を見出すことが重要と考えられた。1 次スクリーニングに脱リン酸化ITK を用い，阻害化合物を見出した後に，化合物の SPR 結合評価を行い，非特異的に作用する化合物を排除した。タンパク質の構造変化を高速で検出する蛍光バイオセンサーおよびSHG 評価系を新たに構築した。これらの評価系でヒットした代表化合物はITK キナーゼパネル評価において高い選択性を示した。本内容は第二章に記載する。

PLTP については通常のHTS では用いない血漿を酵素源としたHTS を行い，さらにSPR 結合評価を実施して，短期間に高質な医薬品候補化合物を見出した。ITKについては精製酵素を用いたHTS に，SPR 結合評価とタンパク質の構造変化検出系を組み入れることで，高選択的な高質な医薬品候補化合物を見出した。このように SPR 結合評価やタンパク質の構造変化の検出を行うことによって，効率の良い高質な医薬品候補化合物探索が可能であることを示した。

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