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Molecular mechanism underlying inter-organelle translocation of piRNA precursor

山城, はるな 東京大学 DOI:10.15083/0002004771

2022.06.22

概要

【研究背景】
PIWI-interacting RNA(piRNA)は、⽣殖組織特異的に発現する⼩分⼦RNAであり、PIWIタンパク質と複合体(piRISC)を形成してトランスポゾンの発現を抑制することでゲノムを保護する。piRNA前駆体はトランスポゾンの断⽚を多く含むpiRNAクラスタと呼ばれる領域から転写された⼀本鎖の⻑鎖RNAであり、これが細胞質において複数のpiRNA⽣合成因⼦によりプロセシングを受けて成熟型の⼩分⼦RNAとなる(図1)。ショウジョウバエ卵巣体細胞において、piRNA前駆体は細胞質のYbbodyと呼ばれる顆粒構造体に集積する。Ybbodyには、Ybタンパク質を中⼼にヘリケースタンパク質であるArmitage(Armi)など複数のpiRNA⽣合成因⼦が局在する。YbはRNA結合タンパク質であり、piRNA前駆体の特定の配列を認識し⾃⼰会合を⾏うことでpiRNA前駆体の選別に寄与する。このYbbodyにおいてpiRNA前駆体の5´末端にPiwiが結合し、prepiRISCが形成される。Ybbodyで形成されたpre-piRISCは、ミトコンドリア外膜に局在するエンドヌクレアーゼZucchini(Zuc)により、Piwiに覆われていない3´末端側が切断を受けることで成熟型piRNAとなる。しかし、Zucは基質の配列認識能は有さず、どのようにしてYbbodyを経たpiRNA前駆体は選択的にミトコンドリア上に輸送されるのか、その分⼦機構は明らかになっていなかった。

先⾏研究のショウジョウバエ卵巣を⽤いた遺伝学的スクリーニングにより、ミトコンドリア外膜タンパク質であるGaszもpiRNA⽣合成因⼦であることが⽰されていた。GaszはAnkyrinrepeatsやSAMドメインといった相互作⽤ドメインを持ち、ミトコンドリア上で⾜場タンパク質として働くことが予想された。そこで本研究ではまずGaszに着⽬することでpiRNA前駆体のYbbodyからミトコンドリアへのオルガネラ間輸送の分⼦機構を解析し、トランスポゾン抑制において重要なpiRNA前駆体を選択的に輸送する制御機構を明らかにすることを試みた。

【研究結果】
ショウジョウバエ卵巣体細胞由来の細胞株OSCにおいて、Gaszをノックダウン(KD)すると、ZucKDと同様に成熟型piRNAの産⽣量が減少し、前駆体が蓄積した(図2A)。これより、GaszはZucによるpiRNAの成熟化に寄与することが⽰唆された。次にYbbodyからミトコンドリア上にpiRNA前駆体を輸送する因⼦を探索するため、OSC細胞抽出液からミトコンドリア画分を単離し、そこに含まれる既知のYbbody構成因⼦の量をウエスタンブロット法により調べた。その結果、ミトコンドリア画分からGaszに加えてPiwi、Armiが検出された。そこでArmiの細胞内局在を免疫染⾊法により調べた。Armiは野⽣型OSCでは主にYbbodyに局在するが、ZucをKDするとミトコンドリアに蓄積することがわかった(図2B)。このArmiのミトコンドリアへの蓄積はさらにGaszもKDすると阻害された(図2C)。これらの結果より、ArmiがGasz依存的にYbbodyからミトコンドリアへ移⾏することが⽰唆された。

そこで、次にGaszとArmi、Piwiのタンパク質間相互作⽤を共免疫沈降法により解析した。その結果、これらの因⼦の相互作⽤が⾒られ、さらにZucをKDすると強まることがわかった。またこの複合体に含まれるRNAをノザンブロット法により検出すると、piRNA前駆体が含まれることが明らかとなった。以上の結果より、Armi–pre-piRISC複合体がYbbodyからミトコンドリアへのオルガネラ間を移⾏し、Gaszがそれをミトコン図1.OSCにおけるpiRNA生合成経路図2.OSCにおけるドリア外膜上につなぎとめることで、ZucによるpiRNA成熟化を促進することが⽰唆された。またKD実験より、Armi–pre-piRISC複合体はGaszに依存せず形成され、Armiに依存してPiwiはYbbodyに局在し、pre-piRISCが形成されることが明らかとなった。次にpiRNA前駆体のオルガネラ間輸送の制御機構を明らかにするため、KDや変異体を⽤いた実験を⾏なった。PiwiをKDするとArmiのミトコンドリアへの蓄積が⾒られなくなり、共免疫沈降におけるGaszとの相互作⽤も阻害された。⼀⽅、GaszおよびArmiの組換えタンパク質を⽤いたinvitroプルダウンアッセイにおいて、GaszとArmiは直接の結合能を有することがわかった。これらの結果より、Piwi⾮存在下ではArmiのYbbodyからの解離が阻害されることが⽰唆された。次に、RNAの5´末端への結合能を⽋失させたMID変異体、3´末端への結合能を⽋失させたPAZ変異体を作製した。PAZ変異体はpiRNA前駆体と結合できたのに対し、MID変異体は結合できなかった。そこでこれらの変異体のArmiとの相互作⽤およびArmiのオルガネラ間輸送への影響を調べた。その結果、ArmiはpiRNA前駆体と結合しないMID変異体とは相互作⽤せず、Ybbodyから解離しないことが明らかとなった。以上の結果より、Armiはpre-piRISCの形成を認識し、その輸送を制御することが⽰唆された。

最後に、piRNA前駆体のオルガネラ間輸送の制御において重要なArmiの機能を解析した。ArmiのRNA結合能変異体(N756A変異体)はPiwiと相互作⽤できるが、Ybbodyからの解離は阻害されることがわかった。⼀⽅、Armiの2つのアイソフォームのうち短いフォームに相当するN末34アミノ酸⽋失変異体(ΔN34変異体)は、RNA結合能やPiwiとの相互作⽤に影響を及ぼさないが、Ybbodyからの解離は阻害された。以上の結果より、ArmiのRNA結合能および機能未知のN末34アミノ酸がYbbodyからの解離に必要であることが⽰唆された。

【考察・展望】
本研究では、❶YbbodyにおいてprepiRISCがArmiに依存して形成され、❷Armiがpre-piRISC複合体の形成を認識し、そのYbbodyからミトコンドリアへのオルガネラ間輸送を制御すること❸その制御にはArmiのRNA結合能とN末34アミノ酸が重要であること❹GaszがArmi–prepiRISC複合体をミトコンドリア外膜上に繋留することが明らかとなった。ミトコンドリア外膜に局在するZucはpiRNA前駆体の配列を認識することができない。さらにZucが正しく前駆体を切断するためには、piRNA前駆体の5´末端がPiwiに結合し、かつ⼀本鎖RNAである前駆体の⼆次構造を解くArmiを必要とする。本研究で明らかにした❶から❹の段階的な制御機構は、PiwiがYbbodyに集められたトランスポゾン抑制性のpiRNA前駆体とpre-piRISC複合体を形成した場合にのみ、pre-piRISCをYbbodyから送り出し、ミトコンドリア上のZucのもとに輸送するために重要な制御機構であると⾔える。本研究ではpiRNA⽣合成が、piRNA前駆体を選別しpre-piRISCを形成するYbbodyと、pre-piRISCの成熟化を⾏うミトコンドリア外膜上という2つの反応の場の間で厳密に制御されることで、効率的なpiRNAの産⽣が果たされていることが⽰唆された。今後ArmiのN末端の機能を調べていくことで、さらなる分⼦機構の理解が期待できる。

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参考文献

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