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CRISPR-mediated establishment and analyses of novel Drosophila cell lines for investigation of the piRNA pathway

住吉, 哲太朗 東京大学 DOI:10.15083/0002001914

2021.10.04

概要

○背景・目的
　PIWI-interacting RNA(piRNA)は、主に生殖組織特異的な小分子RNAである。piRNAはPIWIタンパク質と複合体を形成し、トランスポゾンの発現を抑制することによって、生殖細胞ゲノムをトランスポゾンによるDNA損傷から保護する。生殖細胞の保護に重要なpiRNAは、有性生殖を行う多くの生物で保存されている。piRNAの欠損は、生殖組織の発生・分化を阻害し、その個体は不妊となる。近年は、piRNAが幹細胞やがん細胞などの体細胞においてもごく微量ながら発現することが明らかとなった。piRNAは、体細胞においても、トランスポゾンの抑制などによって、細胞の状態の維持に働くと考えられている。
　piRNAの生合成の分子メカニズムは十分な理解が進んでいない。その一因として、piRNAが多量に発現する生殖系列由来の培養細胞株は極めて少なく、生化学的解析が困難であることが挙げられる。ping-pong機構は哺乳類から無脊椎動物まで生物間に広く保存されている重要なpiRNA生合成機構の一つである。しかし、ping-pong機構を有し、容易な生化学的解析が可能な細胞株は存在しないため、ping-pong機構の分子メカニズム解明は進んでいなかった。ping-pong経路に必須のRNAヘリカーゼタンパク質であるVasaは、ping-pong経路の場である核膜近傍に局在する細胞質顆粒、nuageの形成において中核を担い、Vasaを足場にして他のping-pong関連因子が集積すると示唆されている。nuage形成に関連して、マウスのVasaホモログを用いた先行研究より、N末に存在するdisorder領域が相分離を起こし、顆粒を形成すると報告がある。さらに、Vasaはping-pong機構に使用するRNAをnuageで受け取る役割があり、受け渡しを契機にnuageを形成すると示唆する報告もある。また、Vasaが標的RNAをどのように認識し、乖離するか、その詳細な分子機構も不明である。
　本研究では、ショウジョウバエ卵巣由来の培養細胞株、OSCの遺伝子編集によりping-pong経路の機能する細胞株を樹立した。また、その細胞株を用いて、nuage形成及び、ping-pong経路におけるVasaの生化学的な機能解析を行った。

○方法・結果・考察
1) ∆mbt-OSCの樹立
　ping-pong機構を有するショウジョウバエ由来細胞株の樹立にあたり、先行研究で報告されたl(3)mbt遺伝子に着目した。l(3)mbtは転写抑制因子であり、その変異体は脳腫瘍を誘発する。l(3)mbt変異体の脳腫瘍で発現上昇する遺伝子の解析から、複数の生殖細胞特異的遺伝子が異所的に発現すること、またそれらにはping-pong機構の主要因子が多く含まれることが示された。よって体細胞株のl(3)mbtを欠失させれば、ping-pong機構に関与する因子が発現し、体細胞株がping-pong機構を獲得するのではないかと着想した。そこでCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いて、ショウジョウバエ卵巣体細胞由来培養細胞株OSCのl(3)mbtを恒常的に欠失した株の確立を試みた。OSCを用いたゲノム編集は前例がなかったため、OSCに適した条件の検討を行った。その結果50株から2株程度、新規細胞株∆mbt-OSCを樹立することに成功した。∆mbt-OSCを用いたトランスクリプトーム解析等の結果より、∆mbt-OSCではAubやAGO3、Vasaなどのping-pong機構に必要な因子の発現が見られた(図1A)。∆mbt-OSCはping-pong機構が生じる場であるnuageを有した(図1B)。さらに、piRNAのシーケンス解析を行うと、∆mbt-OSCのpiRNAには、ping-pong機構特異的な特徴がみられた。また、ping-pong機構に必須の因子を発現抑制したところ、ping-pong機構に依存するpiRNAが失われた。これらの結果から、私は∆mbt-OSCがping-pong機構を獲得したことを示した。私が樹立した∆mbt-OSCはping-pong機構を有する唯一のショウジョウバエ由来細胞株である。

2) Vasaの分子動態の解明
　樹立した∆mbt-OSCでは、nuageの形成が確認された。そこで、nuageが形成される機構を解析した。Vasaはping-pong機構に必要なヘリカーゼタンパク質であり、ping-pong機構の場であるnuage形成においても必須の因子である。そこで、Vasaのnuage形成に必要な条件の解析を行った。まずOSCやショウジョウバエ体細胞由来の細胞株であるS2細胞にVasaを強制発現させた。するとS2細胞ではnuageが形成されなかったが、OSCにはnuage様の顆粒が観察された。∆mbt-OSCにおいても、強制発現したVasaはnuageを形成するが、安定したnuageの観察が困難であった。そこで強制発現を行う系では、S2細胞とOSCを用いることにした。VasaはN末端側にdisorder領域をもち、C末側にヘリカーゼ活性をもつ部分が存在する。VasaのヒトホモログであるDDX4は、N末端側の領域が顆粒形成において重要であるという先行研究がある。Vasaのnuage形成に必要な部分を検証するために、Vasaをdisorder領域とhelicase領域の二つに分割した欠損変異体を作製した。2つのVasaを強制発現させたところ、意外にもhelicase領域のみがnuage様の顆粒を形成した(図2A)。先行研究と異なる結果が得られたが、この結果はVasaにおいては、ヘリカーゼ活性に関する部分がnuage様顆粒の形成に重要であることを示唆した。Vasaは、RNAと結合し、ATPを加水分解して、二本鎖になったRNAを乖離させる。そこで、Vasaの点変異体RNA結合変異体(R528A)を作成し、nuage形成を観察した。その結果、R528A変異体においてnuage様の顆粒が見られなかった(図2A)。この結果は、Vasaがnuageを形成するには、VasaのRNA結合能が必要であると示唆する。しかし、顆粒を形成するOSC細胞と顆粒を形成しないS2細胞において、UVクロスリンクを用いたVasaのRNA結合アッセイを行ったところ、いずれの細胞株においても、RNA結合シグナルが観察された(図2B)。Vasaがnuage様の顆粒を形成するには、RNAに結合するだけではなく、他の要素も必要であると考えられる。∆mbt-OSCにおいてRNA存在、非存在下でVasa結合タンパク質を比較したところ、いくつか結合量が異なるタンパク質がみられた。CG7194は、MS解析によってRNA非存在下で、Vasaとの結合が著しく低下する因子である。しかし、CG7194の発現減少はVasaの局在に影響を与えなかった。したがって、CG7194とは異なる未知因子が要求されることが考えられる。
　Vasa結合RNAは、UVクロスリンクによって取得することが可能である。そこで、∆mbt-OSCを用いて、iCLIP法によるVasa結合RNAの同定を試みた。iCLIP法は結合するRNAの配列だけでなく、タンパク質のRNA結合位置を明らかにすることが可能な方法である。次世代シーケンサーを用いた解析の結果、iCLIP法で得られたVasa結合位置とPIWIタンパク質に結合するpiRNAの5’末端の位置は、定まった距離にあることが判明した。この結果は、VasaがpiRNAとPIWIタンパク質の複合体から標的RNAを乖離するときには決まった位置で行う可能性を示した。

3) ゲノム編集によるZuc検出可能細胞株の樹立
　Zucchini(Zuc)は、piRNA生合成に必須のエンドヌクレアーゼである。ZucはN末領域のトランスメンブレン領域によりミトコンドリアに局在し、ミトコンドリア上でpiRNA前駆体を切断することでpiRNAの成熟に寄与する。近年、Zucの結晶構造解析など様々な研究が進められてきたが、これまでZucに対する良質なモノクローナル抗体が作製できず、強制発現を用いた系により解析が進められてきた。そのため、未だZucがpiRNA成熟化に関わる詳細な分子メカニズムの解明には至っていない。そこで、∆mbt-OSC樹立時の条件を活用し、ゲノム上のZuc領域に、アフィニティータグとして頻繁に用いられるFLAGタグ配列を挿入することで、既存の抗体による内在Zucの検出を目指すという着想に至った。FLAGタグ配列の挿入にあたり、ゲノムの欠損を誘導する際に働くKu70を発現抑制し、Cas9の導入時に相同配列をもつFLAGタグ配列を導入した。その結果、Zuc遺伝子へFLAGタグ配列の挿入した細胞株、Zuc-FLAGOSCの樹立に成功した。Zuc-FLAGOSCでは、FLAG抗体を用いた内在Zucの検出が可能である(図3)。ZucにFLAG配列が挿入されたことに起因する未成熟piRNAの増加や、ターゲット遺伝子の脱抑制は見られなかった。強制発現を用いた系では、発現量の調整が難しく免疫染色による局在の確認が困難であったが、Zuc-FLAGOSCを用いたFLAG抗体による免疫染色により局在の観察がより容易になった。今後、Zuc-FLAGOSCを用いたZucのpiRNA生合成における詳細な作用機序の解析が期待できる。

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