Transzonal projectionの再形成とウシ卵母細胞の体外発育に関する研究

概要

Kobe University Repository : Kernel
PDF issue: 2024-05-02

Regeneration of transzonal projections and
growth of bovine oocytes in vitro

伏井, 実穂子
(Degree)
博士（農学）

(Date of Degree)
2023-03-25

(Date of Publication)
2025-03-25

(Resource Type)
doctoral thesis

(Report Number)
甲第8660号

(URL)
https://hdl.handle.net/20.500.14094/0100482408
※ 当コンテンツは神戸大学の学術成果です。無断複製・不正使用等を禁じます。著作権法で認められている範囲内で、適切にご利用ください。

で

別紙様式 3 （博士論文審査等内規第 2条関係）

博士論文内容の要旨
名

氏

伏井実穂子

専攻・講座

資源生命科学専攻・応用動物学講座

論文題目（外国語の場合は，その和訳を併記すること。）

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指導教員

李智博

（氏名：

伏井実穂子

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（別紙 1)

論文審査の結果の要旨

氏名
論文
題目

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区分

職名

主査

准教授

李智博

喜

副査

教授

原山洋

委
員

副査

教授

万年英之

副査

助教

京極博久

副査

名誉教授

宮野隆

氏

要

名

旨

哺乳類の卵巣内で，卵母細胞は卵胞の発達に伴って発育する。原始卵胞内の卵母細胞が発育を開始する
と，卵母細胞を取り囲む顆粒膜細胞は形態を変化させたのち増殖し，卵胞は一次卵胞，次いで二次卵胞と
なる。卵母細胞は発育に伴って顆粒膜細胞との間に透明帯を形成するが，周囲の顆粒膜細胞からは，透明
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の後，顆粒膜細胞間に液で満たされた卵胞腔が形成され，卵胞は胞状卵胞へと発達する。この段階で顆粒
膜細胞は，卵栂細胞を取り囲み， TZPを介して卵母細胞と接する卵丘細胞と，卵胞の内墜を覆う壁顆粒膜
細胞へと分化し，異なる機能を担うようになる。卵母細胞は顆粒膜細胞（胞状卵胞以降では卵丘細胞）か
ら伸びる TZP を介して種々の物質を受け取って発育し，成熟，受精する能力を獲得すると考えられてい
る
。
卵巣内における卵母細胞の発育機構を解明する目的で，また卵巣内に多数存在する卵栂細胞を利用する
目的で，卵母細胞の体外発育培養に関する研究が進められてきた。ウシの卵母細胞は直径約 30μmから約
125μmへと発育するが，初期胞状卵胞から採取した直径約 100μmの発育途上の卵母細胞を体外で発育
させ，体外で成熟，受精させた卵子からは産仔が得られている。ウシ卵母細胞の体外発育培養には，卵母
細胞と周囲の体細胞からなる卵母細胞一卵丘細胞一壁顆粒膜細胞複合体が用いられるが，培養の間，周囲
の体細胞との結合の維持は不可欠であり，また複合体は卵胞腔様の構造を形成することが知られている。
本研究では，初期胞状卵胞から採取した発育途上のウシ卵母細胞の体外での発育を，卵丘細胞あるいは
壁顆粒膜細胞が単独で支える可能性を調べている。その過程で，初期胞状卵胞の卵丘細胞が壁顆粒膜細胞
様の細胞へと変化すること，また墜顆粒膜細胞が，卵母細胞との間に T
Z
Pを伸長して卵丘細胞様の細胞
へと変化することを見出し， さらに研究を発展させ，異なる発達段階の卵胞から採取した顆粒膜細胞の
TZP伸長能と卵母細胞の発育を支える能力を比較するとともに，顆粒膜細胞の発現遺伝子を RNAシーケ
ンス (
RNA・seq) によって解析し，卵胞の発達過程における顆粒膜細胞の分化と TZP形成能の変化につ
いて検討している。
第 I章では，哺乳類の卵子形成過程，卵胞の発達過程と顆粒膜細胞の分化について概説するとともに，
ウシ卵母細胞の体外培養の現状について説明し，卵母細胞一卵丘細胞一壁顆粒膜細胞複合体による卵胞腔
様構造の形成とその機能，卵母細胞と顆粒膜細胞／卵丘細胞をつなぐ TZP の重要性について言及し，卵
丘細胞あるいは屹顆粒膜細胞が単独で卵母細胞の体外での発育を支える可能性を調べる本研究の目的を
述べている。

第I
l章では，ウシ卵母細胞の発育を卵丘細胞が単独で支える可能性を調べている。直径 0
.
5
,
.
.
_
_
_
,
0
.
7
m
mの
初期胞状卵胞から採取した直径約 lOOμmの発育途上の卵母細胞を含む卵母細胞一卵丘細胞複合体を 2週
間にわたって発育培養し，複合体の発達，卵胞腔様構造の形成，卵母細胞の発育と成熟能力について調べ
ている。また，卵胞腔の形成を促進することが知られている卵胞刺激ホルモン (FSH:
0-50mIU/ml)
の影響を調べている。その結果， FSH無添加の培養液中でも卵母細胞一卵丘細胞複合体は発達して卵胞
腔様構造を形成すること， FSHは複合体による卵胞腔様構造の形成開始を早めるが，高濃度 (
1
0および
50mIU/ml) では，複合体の発達や卵母細胞の発育に悪影響を及ぼすことを示している。また， FSH無 添

氏名

I

伏井実穂子

) を添加した場合には，卵母細胞は高率に発育を完了して 成熟能力を獲
l
m
/
1mIU
加および低濃度の FSH (
得することも明らかにしている。これらの結果から，ウ シの卵母細胞の発育は卵丘細胞単独でも支えられる
こと，また卵丘細胞は，卵胞腔様構造を形成する過程で ，壁顆粒膜細胞様の細胞へと変化する可能性を示唆
している。
I章では，ウシ卵母細胞の発育を壁顆粒膜細胞が単独で支 える可能性を調べる目的で， TZPを持たない
I
第I
卵母細胞を作出した後，体内では TZPを持たない壁顆粒膜細胞と共培養し， TZPの再形成を経時的に調べ
ている。まず，発育途上のウシ卵母細胞を裸化した後， 24時間培養すると， TZPがほぼ完全に消失するこ
とを， TZP中の Fアクチンを蛍光染色し，共焦点レーザー顕微鏡で観察す ることによって確認している。次
いでこの卵母細胞を，初期胞状卵胞より別途準備した壁顆 粒膜細胞とともに培養し， TZPの再形成を調べて
いる。その結果，共培養 24時間後には，裸化卵母細胞が壁顆粒膜細胞と複合体を構 築し，壁顆粒膜細胞と
卵母細胞との間に TZPが再形成されること，その後， TZP数は経時的に増加し，共培養 72時間後には体内
1 mIU/ml)
で発育した卵母細胞と同等となることを観察している。 さらに，この実験系を用いて， FSH (
ら，培養下で，壁顆粒膜細胞は卵母細胞に
は TZP数の増加を遅らせることも示している。これらの結果か
向かって TZPを伸長させる，すなわち卵丘細胞様の細胞へと変化する 可能性を示唆している。
V章では，前章の研究を発展させ，種々の発達段階の卵胞 から顆粒膜細胞を採取し，卵母細胞の発育を
第I
支える能力を比較している。 TZP を消失させた発育途上の卵母細胞を，直径 0.2~0.4 m mの二次卵胞から
採取した顆粒膜細胞，直径 4 6mmの発達した胞状卵胞（後期胞状卵胞）から採取した壁顆 粒膜細胞と共
培養して，複合体の構築と TZPの再形成を調べ，初期胞状卵胞 (O.5 0.7mm) の壁顆粒膜細胞と比較して
いる。また，伸長した TZP が機能することを，その後の複合体による卵胞腔様構造 の形成，卵母細胞の発
育と成熟能力を比較することによって調べている。その 結果，二次卵胞の顆粒膜細胞は，初期胞状卵胞の壁
顆粒膜細胞と同様に TZP を伸長して卵丘細胞様細胞へと変化すること，また複合 体は発達して卵胞腔様構
造を形成し，卵母細胞は発育して成熟能力を獲得するが ，一方，後期胞状卵胞から採取した壁顆粒膜細胞は
TZP伸長能が低く，卵母細胞の発育を支えないことを明らか にしている。さらに，これら 3種の卵胞から採
取した顆粒膜細胞，卵丘細胞および壁顆粒膜細胞の RNA-seq解析を行い，二次卵胞の顆粒膜細胞は，壁顆
粒膜細胞と卵丘細胞への異なる 2方向に向かって分化することを示している。また， TZPを伸長する能力の
ある顆粒膜細胞（二次卵胞の顆粒膜細胞，初期胞状卵胞 の卵丘細胞と壁顆粒膜細胞）と TZP を伸長する能
カのない顆粒膜細胞（後期胞状卵胞の壁顆粒膜細胞）の 発現遺伝子を比較すると， Fアクチンの形成や糸状
) の形成に関与する遺伝子のいくつかに差があることも見 出している。これらの RNA-seq
m
u
i
d
o
p
o
l
i
f
仮足 (
解析の結果から，二次卵胞の顆粒膜細胞は後期胞状卵胞 の壁顆粒膜細胞へと分化が進行する過程で， TZP伸
長能を消失する可能性を示唆している。
第 V章では，以上の結果をまとめ，初期胞状卵胞から採取し た発育途上のウシ卵母細胞は，卵丘細胞単独
でも発育し成熟能力を獲得すること，また，二次卵胞の 顆粒膜細胞および初期胞状卵胞の壁顆粒膜細胞によ
っても卵母細胞は発育し成熟する能力を獲得すると結論 づけている。さらに，初期胞状卵胞までの発達段階
では，顆粒膜細胞，卵丘細胞および壁顆粒膜細胞は， TZPの伸長，卵胞腔様構造の形成，卵母細胞の発育支
持といった共通の特性を有するが，卵胞がさらに発達す る過程で，壁顆粒膜細胞はこれらの能力を失う可能
性を示唆している。
以上のように，本研究は，ウシ卵母細胞の体外発育培養 系を用いて，卵胞の発達過程における顆粒膜細胞
の分化と TZP 形成能の変化について研究したものであり，生殖生物学•発生工学分野における重要な知見

を得たものとして価値ある集積であると認める。よって ，学位申請者の伏井実穂子は，博士（農学）の学位
を得る資格があると認める。