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甲状腺刺激ホルモン (TSH)によるSlc26a7の発現調節機構の解明

谷村 優太 山梨大学 DOI:info:doi/10.34429/00004998

2021.03.23

概要

【目的】
ヨードは甲状腺ホルモンの生合成に必須であり、ヨードの低下が甲状腺機能低下症の原因となる。甲状腺は一層の上皮細胞で囲まれた濾胞構造を持ち、血中から濾胞へヨードを輸送し甲状腺ホルモンT3、T4を生合成している。ヨードの取り込みは主に濾胞上皮細胞の基底側にあるナトリウム/ヨウ素イオン共輸送体SLC5A5 (NIS; solute carrier family 5 member 5)を通して濾胞上皮細胞内に輸送し、内腔側の陰イオン交換体SLC26A4 (pendrin)やヨードチャネルなどによって濾胞腔内に運ばれる。近年、先天性甲状腺機能低下症の原因遺伝子として同定されたSLC26A7が、濾胞上皮細胞内腔側に発現する新たなヨードトランスポーターであることが明らかになった。しかし、甲状腺におけるSLC26A7の発現調節機構については、未だ不明な点が多い。

本研究では、甲状腺ホルモン生合成に必要な多くの遺伝子発現を転写レベルで誘導を促す甲状腺刺激ホルモン (TSH)が、Slc26a7の発現調節や細胞内局在に与える影響について、甲状腺のヨードトランスポーターであるSlc5a5、Slc26a4と比較しながら検討を行った。

【方法】
ラット由来の甲状腺細胞株FRTL-5細胞を用いて、以下の1), 2), 3)の検討を行った。
1) 0.01-1 mU/mLのTSHを培養液にそれぞれ添加し、TSHの濃度変化および6-24hの経時変化によるSlc26a7、Slc26a7、Slc26a4の遺伝子発現をreal-time PCRで評価した。また、TSHシグナルの下流にあるアデニル酸シクラーゼを活性化するforskolin、cyclic AMP誘導体であるdibutyryl cAMP (dbcAMP)によるSlc26a7、Slc26a7、Slc26a4の遺伝子発現も同様に解析した。さらに、 TSH、forskolin、dbcAMPによるSlc26a7のタンパク質の発現をWestern blottingで評価した。

2) TSH/cAMPシグナルがSLC26A7の転写調節の影響を調べるために、SLC26A7遺伝子の5’フランキング領域をPCRで増幅し、pGL3-Basicに組み込みレポータープラスミドを作製し、ルシフェラーゼアッセイによってSLC26A7のプロモーター活性を評価した。

3) Slc26a7 の細胞内局在を明らかにするために、1 mU/mL の TSH を加え、Slc26a7 の免疫蛍光染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で細胞内局在の変化を観察した。

【結果】
本研究により、大きく以下の結果が得られた。
1) Slc26a7の発現は、TSH、forskolin、dbcAMPにより抑制される。
FRTL-5細胞を用いてTSHによる各ヨードトランスポーターの遺伝子発現をreal-time PCRで評価した結果、Slc26a7、Slc26a4遺伝子発現はTSH濃度依存性に抑制された。一方、Slc5a5の遺伝子発現は、TSH濃度依存性に誘導された。Forskolin、dbcAMP添加においても、TSHと同様にSlc26a7遺伝子発現は濃度依存性に抑制された。さらにWestern blottingを用いて、タンパク質の発現を評価した結果、TSH、forskolin、dbcAMPによってSlc26a7のタンパク質発現は濃度依存的に抑制された。

2) SLC26A7プロモーター活性は、TSH/cAMPシグナルの活性化により抑制される。
TSH、forskolin、dbcAMPによって、SLC26A7の5’ -2,207から-1,653のプロモーター領域で活性の抑制が確認された。PROMOおよびCiiiDERを用いて解析した結果、甲状腺転写因子である NKX2-1 (TTF-1)の結合領域に位置していることから、他の甲状腺特異的遺伝子の転写制御と類似して、TSH/cAMPシグナル伝達の影響を介してSLC26A7プロモーター活性を制御していることが示唆された。

3) Slc26a7タンパク質はTSHにより核近傍から細胞膜へ局在する。
TSH非存在下の培地では、Slc26a7タンパク質が核の近傍に分布しているが、TSHにより、Slc26a7は6-12hで核周辺から細胞質に移動し、その後24-120hで細胞膜に局在が変化した。

【考察】
TSH、forskolin、dbcAMPによってSlc26a7の発現が抑制され、3つのNKX2-1結合部位を含む SLC26A7プロモーター活性も抑制されることから、TSH/cAMPシグナルの活性化によるSLC26A7プロモーター活性の抑制は、NKX2-1の発現抑制を媒介していることが示唆された。また、これまでの研究でTSHによってSlc26a4の細胞膜局在が誘導されることが示されていたが、本研究により Slc26a7においても同様の結果が得られたことから、TSHによる細胞内局在の変化は、Slc26a7の遺伝子やタンパク質発現の調整に加え、ヨード輸送能を活性化していることが示唆された。これらの結果は、TSHによるSlc26a7の発現調節機構とトランスポーター機能等の甲状腺の生理機能の解明につながるものである。

【結論】
FRTL-5細胞において、TSH/cAMP刺激によりSlc26a7は遺伝子、タンパク質発現ともに抑制され、 SLC26A7プロモーター活性も抑制されることを明らかにした。一方で、TSH刺激によりSlc26a7は細胞膜に局在が誘導され、ヨード輸送能の活性化を示唆する結果を示した。

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