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ネコ科動物種の保存に向けた体外受精における新技術の活用に関する研究

辻本 恭典 大阪府立大学 DOI:info:doi/10.24729/00017419

2021.06.10

概要

近年、多くのネコ科動物が生息地の減少や違法な狩猟により生息数を減らし、その結果、一部のネコ科動物は絶滅の危機に瀕している。これらの種を保存し、生物の多様性を維持するためには、配偶子を保存することや、体外受精などの体外胚発生技術を利用して人工的に子孫を増やすことが必要だと考えられている [Comizzoli, 2015]。絶滅危惧種に指定されているネコ科動物では、精巣や卵巣などの研究材料を得る機会が乏しく、生殖補助医療技術の研究を行うのが難しい状況である。そこで、身近な動物であるイエネコで研究を行い、その知見をネコ科動物に応用することが絶滅の危機に瀕している動物を救う手段の一つになると考えられている[Pope, 2000]。

哺乳動物における体外胚発生の過程は、卵巣から取り出した未成熟卵子を受精可能となるまで成熟させる体外成熟 (in vitro maturation：IVM)、成熟卵子を雄性配偶子と体外で受精させる体外受精 (in vitro fertilization：IVF)、および受精卵を個体発生可能な胚盤胞期胚までに発生させる体外培養 (in vitro culture：IVC) で構成されている。1970 年代に、ネコにおける IVF [Hamner et al., 1970]および胚盤胞期胚の作製 [Bowen, 1977]が世界で初めて報告されている。しかし、卵子と精子を共培養する通常の IVF には、6 × 105 個以上程度の運動性を強くもつ精子が必要[Spindler and Wildt, 1999]であり、入手できる精子数が限られる絶滅危惧種のネコ科動物では通常の IVF を行える回数に限りがある。さらに、ネコ科動物の多くの種において、精子の 60%以上に形態的・機能的異常が認められているとされ[Pukazhenthi et al., 2001 および 2006]、IVF をより困難にしている。さらに、通常の IVF では運動性のある成熟精子しか使用できないため、死亡した個体や性成熟していない個体の精巣内にある造精細胞を利用できない。これらの問題を解決する方法として、ヒトの不妊治療などで効果を発揮している細胞質内精子注入法 (intracytoplasmic sperm injection： ICSI) がある。

ICSI は一つの精子を直接卵子に注入する方法で、1976 年にハムスターで透明帯通過や卵細胞との膜融合過程を経ずに卵細胞内に雄性前核を形成できることが報告された[Uehara and Yanagimachi, 1976]。その後、ウサギ[Keefer, 1989]やウシ[Goto et al., 1990]、ヒト[Palermo et al., 1992]など多くの動物種で産子も報告されている。この ICSI には Conventional ICSI とPiezo マイクロマニピュレーターを用いた Piezo ICSI の 2 種類がある。Conventional ICSI では、先端を鋭利に加工したピペットを用いて透明帯を穿通し、細胞質内に精子を送り込む。しかし、透明体は非常に強靭で伸展性に富むため、ピペットの先端を卵細胞に強く押しつけなければならないため、卵細胞が著しく変形して内圧が上昇する。さらに、卵細胞膜も伸展性に富むため、それを穿通するために細胞質を吸引する必要がある。したがって、Conventional ICSI では、卵細胞に与えるダメージが大きく、このことがヒト生殖医療や希少動物保全への応用において問題となっている[Yanagida et al., 1999]。一方、Piezo ICSI の場合は先端が平坦なピペットを用い、圧電素子（piezo electric element）の伸縮を利用して 0.1 μm以下の超微動をピペットに持たせたもので、この超微動により透明帯に少しずつ穴を空けて、透明帯を変形させることなく穿通することができる。さらに、卵細胞膜も細胞質の吸引無しに確実に穿通できる[Yanagida et al., 1999]。マウスにおいて、Piezo ICSI は Conventional ICSI よりも高い生存率と受精率を示すことから[Kimura and Yanagimachi, 1995]、その後多くの動物種でも応用されており、ヒト[Yanagida et al., 1999]やラット[Dozortsev et al., 1998]、ウシ[Katayose et al., 1999]、ウサギ[Suzuki et al., 2000]などにおいても有意に良好な成績を示すことが報告されている。

体外胚発生で使用する配偶子の確保には、精子の保存および輸送の簡易化も重要である。現在、液体窒素下で精子を凍結する保存がさまざまな動物種で広く普及している[Sherman, 1964; Tada et al., 1990; Stachecki et al., 1994]。しかし、この方法では精子を半永久的に保存できるが、定期的な液体窒素の補充が必要である。さらに-196℃の凍結保存精子を輸送する際には、国際規格に合った液体窒素容器や液化窒素を吸収体に吸着させて-196℃で搬送可能な専用の容器であるドライシッパーを用いる必要があり、手間や費用がかかるという欠点も存在する。この問題を解決する手段として、近年、4℃あるいは室温でも保存できる真空凍結乾燥 (フリーズドライ) 技術を使用した精子の保存方法[Wakayama and Yanagimachi, 1998; Ward et al., 2003; Kaneko and Nakagata, 2005, Kaneko and Serikawa, 2012a]が注目されている。ネコにおいて、このフリーズドライ技術を用いた精子保存が可能となれば、保存時に液体窒素を購入・補充する必要がないため、管理が容易となり、維持費のコストも大幅に削減できる。さらに、精子を常温でかつ簡便に国際輸送できるので、遺伝資源の活用の場が広がると考えられる。

本研究では、ネコ科動物の保存に向けた体外受精における新技術の活用を目的とし、第1 章としてPiezo ICSI を用いたネコ精巣上体精子の顕微授精を試み、第 2 章として、ネコ精巣内造精細胞を用いた顕微授精を検討した。さらに第 3 章として、ネコ精子の保存におけるフリーズドライ技術の有効性について検討した。

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