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Amplified luminescence proximity homogeneous assay法を用いた自己免疫性蕁麻疹の新規検査法の開発

古賀 祐基 広島大学

2022.03.23

概要

【背景・目的】
自己免疫性蕁麻疹(aiCSU)患者の多くはIgE抗体や高親和性IgE受容体αサブユニット(FcεRIα)に対するIgG自己抗体を有している。現在、aiCSUは自己血清皮内テスト(ASST)やヒスタミン遊離試験(HRT)の結果をもとに診断されている。しかし、ASSTはしばしば偽陽性が認められる、HRTは検査に健常者の好塩基球を必要とするなど汎用性に欠点がある。また、ELISA法などの免疫学的検査法は、ヒスタミン遊離活性を有していない自己抗体が検出されるため、aiCSU診断の特異度は低い。本研究では、簡便かつ高精度な自己免疫性蕁麻疹の新規検査法を開発することを目的として、FcεRIαまたはIgE抗体で標識したamplifiedluminescenceproximityhomogeneousassayビーズを用い、FcεRI受容体架橋能を有する自己抗体を検出する方法(AlphaCL法)を構築し、その有用性を評価した。

【方法】
ASSTまたはHRTで陽性を示したaiCSU患者21名の血清を用いた。また、コントロールとして健常者9名の血清を用いた。HRTは、2名の健常者末梢血から得られた好塩基球を用いて実施した。未処理および乳酸処理によりIgEを除去した好塩基球に患者血清を添加し、37℃で40分間反応させた際に、上清中に遊離および細胞に残存したヒスタミン量をHPLCで測定した。各ヒスタミン量からヒスタミン遊離率を算出し、遊離率が5%以上を陽性とした。本研究では、乳酸処理した好塩基球からのヒスタミン遊離率が未処理の遊離率より高い場合を抗FcεRIα自己抗体型と定義した。AlphaCLによる抗FcεRIα自己抗体の検出は、リコンビナントヒトFcεRIαで標識したアクセプタービーズ(終濃度20μg/mL)およびドナービーズ(5μg/mL)を用い、4%に希釈した血清と室温・遮光下で1時間反応させた。また、抗IgE自己抗体の検出では、ヒトIgEで標識したアクセプタービーズとドナービーズ(両終濃度20μg/mL)を1%の血清と室温・遮光下で24時間反応させた。反応終了後、Enspire™マルチモードプレートリーダーで発光強度(励起波長,680nm;検出波長,615nm)を測定した。

【結果・考察】
HRTの結果、21名のaiCSU患者のうち、抗FcεRIα自己抗体型の患者は9名、抗IgE自己抗体型の患者は4名、どちらにも陰性を示した患者は8名だった。AlphaCLを用いて、aiCSU患者血清中の抗FcεRIα自己抗体を検出した結果、健常者血清ではシグナルが検出されなかったが、患者血清では21名のうち13名(61.9%)で蛍光シグナルが検出された。このとき、抗FcεRIα自己抗体に対するHRTで陽性を示した患者9名のうち7名(77.8%)でシグナルが検出された。一方、HRT陰性患者12名のうち6名でもシグナルが検出された。HRT陽性患者におけるAlphaCLのシグナル値(平均±標準偏差,7,053±12,510counts)は、陰性患者(291±472counts)よりも高い傾向を示した(P=0.07)。以上の結果から、AlphaCLはHRTで検出できなかった抗FcεRIα自己抗体も検出できる可能性が示唆された。今後、さらに検体数を増やしてAlphaCLの感度や特異度、カットオフ値を定める必要がある。次に、AlphaCLを用いて、aiCSU患者血清中の抗IgE自己抗体を検出した結果、健常者血清ではシグナルは検出されなかったが、患者血清では21名のうち3名(14.2%)でシグナルが検出された。このとき、抗IgE自己抗体に対するHRTで陽性を示した患者4名のうち2名(50%)でシグナルが検出された。HRT陽性患者におけるAlphaCLのシグナル値(1,042±1,212counts)は、陰性患者(159±655counts)よりも高い傾向を示した(P=0.05)。本研究では、AlphaCLによる抗IgE自己抗体の検出感度は抗FcεRIα自己抗体の検出感度よりも低かった。その要因として、血清タンパク質が抗IgE自己抗体のIgE抗体への結合を阻害している可能性が考えられる。今後、血清タンパク質を除去するなどの方法で検出感度を向上させる必要があると考えられる。

【結論】
本研究では、aiCSU患者の血清中に含まれる抗原架橋能を有する自己抗体を検出する新規検査法(AlphaCL)の開発に成功した。AlphaCLによる抗FcεRIαと抗IgE自己抗体の検出感度(15/21,71.4%)はHRT(13/21,61.9%)よりも高く、簡易的かつ実用的な検査法である。本研究の成果は今後、aiCSU患者の新しい診断法に応用が期待できる。

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