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Amyloid Beta Is Internalized via Macropinocytosis, an HSPG- and Lipid Raft-Dependent and Rac1-Mediated Process

Nazere Keyoumu 広島大学

2022.09.20

概要

【目的】
アルツハイマー病は最も頻度の高い認知症疾患であるが、その治療法は存在しない。病理学的に、神経細胞外に存在する老人斑と神経細胞内の神経原線維変化がその特徴であり、老人斑の主成分は42個のアミノ酸からなるアミロイドβペプチド(Αβ42)である。Αβは容易に重合および凝集し脳内で不溶化することから、老人斑としての脳内沈着を介しアルツハイマー病の病態が進行すると考えられている(アミロイド仮説)。一方、不溶化したΑβに加え、オリゴマー化した可溶性のΑβ (οΑβ42)も神経細胞を障害する作用を有すること、さらにoAβ42が細胞外だけでなく細胞内にも存在することが最近の研究によって明らかとなり、神経細胞におけるその代謝・蓄積メカニズムについての検討が活発に行われている。細胞内にoAβ42が存在する機序については、①細胞内で産生されたoAβ42が先に細胞内Αβ42として蓄積した後に細胞外に排出され、不溶性の老人斑として蓄積する可能性と、②細胞外で産生された可溶性oAβ42が老人斑の形成後にも残存して、細胞内に取り込まれる可能性、の2つが考えられる。本研究では、後者に着目し、特定のエンドサイトーシス機構がoAβ42の内在化に関与しているか細胞実験系をもちい検討した。

【方法】
蛍光標識された合成Αβ42ペプチドをStineらの標準的な方法によってオリゴマー化し、oAβ42を作成した。実験対照として、モノマー化したAβ42 (mAβ42)をもちいた。mAβ42と oAβ42の品質確認は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって行った。異なる濃度・時間で、 mAβ42ならびにoAβ42を神経系のNeuro2A、SH-SY5Y細胞株に添加し、細胞内のAβ42取り込みを蛍光顕微鏡で観察し、定量した。oAβ42の取り込みに、膜ドメインである脂質ラフトが関与するのかを明らかにするため、脂質ラフトをコレラ毒素のサブユニット(CTB)で標識し、シクロデキストリン(MβCD)をもちいてラフトをあらかじめ崩壊させたのち、同様の実験を行った。さらに、細胞表面に存在するへパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)の関与を明らかにするため、HSPGの阻害剤へパリン投与ならびにトリプシン処理よりHSPGを切断する前処置を行ったのち、同様の実験を行った。最後に、脂質ラフトやHSPGが関与するエンドサイトーシスの下流の制御因子として低分子量GTPaseであるADPリボシル化因子タンパク質6(Arf6)やRaelが関与することから、oAβ42投与後のArf6、Raelの活性を吸光度ベースの活性化アッセイにより経時的に測定した。

【結果】
Neuro2A、SH-SY5Y細胞はいずれも濃度依存的かつ時間依存的にoAβ42を内在化した。内在化したOAβ42の量は、mAβ42のそれと比較して有意に高かった。エンドサイトーシスの様式の一つであるマクロピノサイトーシスを標識するデキストランと共にoAβ42を投与したところ、デキストランとoAβ42は細胞内で共局在していた。そこで、マクロピノサイトーシス阻害剤であるethyl-isopropyl amilorideならびにWortmannin処理を行ったところoAβ42の内在化は抑制された。以上より、oAβ42はマクロピノサイトーシスにより内在化することが示唆された。さらに、脂質ラフトを崩壊させる条件(20mM MβCD添加)では17.5%まで、HSPGをへパリンで阻害もしくはトリプシンで切断した条件下でもそれぞれ14.5%、14.9%までoAβ42の内在化が阻害された。マクロピノサイトーシスの際は低分子量GTPaseのArf6やRaelの活性が一過性に上昇する。そこで、oAβ42投与後にそれらの活性を測定したところ、Arf6活性に有意な変化は見られなかった一方、Raelの活性が7分後に3.0倍上昇した。さらに、Arf6、Raelそれぞれの阻害剤を使用した実験では、後者でのみNeuro2A細胞におけるoAβ42の内在化が 61.4%減少した。以上の結果から、οΑβ42は、脂質ラフト、HSPG依存性にRael制御性のマクロピノサイトーシスにより細胞に取り込まれることが明らかになった。

【結論】
本研究により、細胞外の可溶性oAβ42がマクロピノサイトーシスにより神経細胞に取り込まれることが示された。本結果は、①アルツハイマー病脳で観察される細胞内oAβ42蓄積が起こるメカニズムに洞察を与え、②アルツハイマー病における細胞内oAβ42の病原性を仮定すれば、脂質ラフト、HSPG依存性のoAβ42エンドサイトーシスがアルツハイマー病治療戦略の一つとして今後探索され得ることを示す。

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