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ヒトiPS細胞由来内胚葉及び腸管上皮細胞の分化誘導法の開発

邱 施萌 Qiu Shimeng 名古屋市立大学

2021.09.24

概要

新薬開発において、膨⼤な時間、莫⼤な資⾦がかかることにもかかわらず、新薬開発の成功確率は約 12%しかないと⾔われるほど困難である[1-3]。⻑きに渡り研究された新薬は、上市前に失敗に終わることが多々ある。新薬開発の成功率を上げるためには、創薬の早期段階に、薬物の有効性及び安全性を正確に予測することが⼤切である[1, 4]。肝臓は、シトクロム P450 （CYP） 3A4 など様々な薬物代謝酵素及び薬物トランスポーターが多く存在することから、薬物代謝の中⼼的器官である[5]。⼩腸には、ペプチドを吸収するトランスポーターPeptide transporter 1（PEPT1）や P-glycoprotein（P-gp）を代表とする排泄トランスポーターが存在し、栄養素や薬物などの吸収に緊密に関わっている。また、CYP3A4 や CYP2C9 などの薬物代謝酵素は⼩腸にも豊富に発現している[6, 7]。したがって、薬物の有効性及び安全性を評価するには、肝臓における薬物の代謝及び⼩腸における薬物の吸収・代謝を正確に予測することが重要である。

現在、⾮臨床試験において薬物動態評価には、in vivo モデルとして、マウスやラットがよく使われているが、ヒトとの種差があるため、ヒトへの外挿性が低い [8]。そこで、種差の問題を避けるために、in vitro モデルでの評価も⾏われている。肝臓における薬物代謝の評価には、凍結ヒト肝細胞が肝臓の代替モデルとして広く使⽤されている[9]。しかしながら、凍結ヒト肝細胞はロット間差が⼤きく、良質なロットであっても数量に限りがあること、維持培養によって薬物動態学的機能などの機能が急激に低下することが課題として挙げられている[10]。また、腸管の薬物吸収及び代謝を予測するには、ヒト結腸癌由来細胞株（Caco-2 細胞）や⼩腸ミクロソームなどが⽤いられている。しかし、Caco-2 細胞は薬物代謝酵素の発現が低く、排出トランスポーターである P-gp の評価に使われているが、薬物トランスポーターの発現パターンはヒト⼩腸と異なる[11-13]。そこで、ヒト⼩腸上⽪細胞の利⽤が望ましいものの、創薬研究などにおける安定的な⼊⼿は困難である。また、⼩腸ミクロソームは膜結合酵素による薬物代謝のみの評価に加え、トランスポーターと薬物代謝酵素の両⽅の寄与を含めた評価は不可能である。したがって、ヒト⽣体における薬物の腸管吸収率を in vitro にてより正確に評価することは困難である。そこで、ヒト⽣体に近い薬物動態学的機能を有し、安定供給可能な腸管細胞及び肝細胞が評価モデルとして利⽤できるようになることが望まれている。

⼈⼯多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：iPSC）は成熟した体細胞に特定因⼦を導⼊することにより樹⽴され、胚性幹細胞（ES 細胞）に類似した多能性を持つ幹細胞である[14]。ヒト iPSC は内胚葉、中胚葉及び外胚葉からなる三胚葉へ分化することができ、さらに⽣体を構成する様々な細胞への分化が可能である[15]。また、ヒト iPSC はその由来となる体細胞と同じ遺伝⼦背景を持つ
特徴がある。そのため、ヒト iPSC より分化誘導した細胞、組織及び臓器は再⽣医療分野、疾患モデルの作製、及び創薬研究への応⽤が期待されている[16]。今までヒト iPSC 由来腸管細胞及び肝細胞への分化法はいくつか報告されているが [17-19]、分化誘導した細胞は薬物動態学的機能がまだ不⼗分であるため、⾮臨床試験において評価⽤モデルとして使⽤することは困難である。本研究では、より⽣体に類似した薬物動態学的機能を有する腸管細胞及び肝細胞を作製するため、ヒト iPSC の分化誘導法の開発を⾏った。

分化過程において、各段階の分化効率は最終的に得られる細胞の性質に⼤きく左右されることが知られている[20]。腸管細胞及び肝細胞は内胚葉由来細胞であり[21, 22]、より⽣体に類似する腸管細胞及び肝細胞を作製するため、効率の良いヒト iPSC 由来内胚葉の分化法を選択することは重要である。したがって、本研究ではヒト iPSC 由来内胚葉の分化誘導法を最適化することを中⼼にして検討を⾏った。さらに、最適化した⽅法によって分化誘導した内胚葉を腸管上⽪細胞及び肝細胞へ分化し、得られた腸管上⽪細胞及び肝細胞の薬物動態学的機能を評価した知⾒について論ずる。

ヒト iPSC から腸管細胞への分化誘導について、多くの報告では発⽣過程に基づいて iPSC に様々な液性因⼦を段階的に処理して作製する[23, 24]。このような⽅法で作製した腸管細胞は、薬物動態学的機能が低いといった⽋点があると報告されている。分化細胞を成熟させるためには、⽣体内環境を模倣することが特に重要であるとされている。実際のヒトの⽣体内では消化酵素によって消化されない難消化性成分である⾷物繊維が腸内環境を整える役割を担っている[25, 26]。そこで、より成熟したヒト iPSC 由来腸管上⽪細胞を得ることを⽬的とし、⼊⼿可能な⾷物繊維を⽤い、ヒト iPSC から腸管上⽪細胞への分化誘導に与える影響及びそのメカニズムについても検討を⾏った。

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