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マウス胃オルガノイドを用いたWnt阻害因子Dickkopf 3のエピジェネティックな変化による転写因子T-box3を介した加齢に伴う胃発癌機序の解明

竹内 章夫 東北大学

2022.03.25

概要

【背景・目的】加齢はがんの危険因子である。加齢に伴う老化の原因として幹細胞老化という概念が提唱されており、病的な幹細胞老化の 1 つとして発がんが考えられている。近年、Wnt/β-catenin シグナルを人為的に調整し幹細胞由来の 3 次元培養を行うオルガノイド培養系が確立してきた。胃に関してもオルガノイドを用いた分化や発癌機序の研究が進む一方、加齢がどのように胃発癌に寄与するかに関しては未だ不明な点が多い。本研究は、加齢マウス由来のオルガノイドを樹立し、幹細胞の観点から加齢による胃発癌機序を解明することを目的とした。

【方法】若年および加齢マウス胃粘膜からオルガノイドを作成し形態を確認後、細胞増殖能と TCF レポーターアッセイで Wnt/β-catenin シグナル活性を測定した。次に加齢由来胃オルガノイドの遺伝子発現を、Microarray を用いて網羅的に解析し、 Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (q-PCR)法と免疫蛍光染色で確認した。細胞老化は Senescence-associated β-galactosidase 法で評価した。さらに Wnt/β-catenin シグナルを制御する遺伝子発現を確認後、Methylation-specific PCR 法で DNA メチル化状態を検討した。最後にヒト固有胃腺と粘膜内胃癌に対して免疫組織化学を行い、発現を検証した。

【結果】加齢由来胃オルガノイドは若年由来と比較し、大きなオルガノイドが形成され、細胞増殖能は 2.71 倍亢進し、Wnt/β-catenin シグナルも 2.89 倍と活性化していた。また、長期継代培養が可能であった。 次に Microarray 解析データを基に Gene Set Enrichment Analysis を行ったところ、“G2/M Checkpoint”関連遺伝子群との相関、および“Senescence”関連遺伝子群との逆相関を認めた。実際に細胞周期を調節する p19ARF、p53、p21WAF1 の発現低下と Cyclin B1 の発現亢進を認め、細胞老化は抑制さ れていた。そして、Wnt 標的遺伝子の中で転写因子 T-box3 (Tbx3)の発現誘導を認め た。Wnt/β-catenin シグナルのニッチ因子の中で、分泌型糖蛋白質 Dickkopf 3 (Dkk3) が加齢マウス胃粘膜で 1.73 倍と発現増加傾向を認めた一方、逆に加齢由来胃オルガ ノイドでは 0.0016 倍と著しく発現低下していた。Dkk3 リコンビナント蛋白添加によ って加齢由来胃オルガノイドの増殖は抑制された。マウス Dkk3 の intron1 領域には CpG island が存在し、加齢由来胃オルガノイドで若年由来より DNA メチル化状態に あった。ヒト胃粘膜における TBX3 の発現は、免疫組織化学的に非萎縮固有胃腺、 萎縮固有胃腺、分化型粘膜内癌の順に増加していた。

【結論】加齢マウス胃粘膜では DNA メチル化により Dkk3 発現が抑制されている幹細胞クローンが出現し、Wnt/β-catenin シグナルの活性化により Tbx3 発現が亢進することによって、G2/M 期が進行し、細胞老化が回避され、細胞増殖能が亢進することが明らかとなった。本機序が加齢に伴うヒト胃癌発症に関与する可能性が示唆された。

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