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Extracellular vesicles synchronize cellular phenotypes of differentiating cells

Minakawa, Tomohiro 京都大学 DOI:10.14989/doctor.r13479

2022.03.23

概要

胚の発生は非常に緻密に調整されたプロセスである。正常な組織を形成するためには、個々の細胞が協調して分化しなければならない。発生過程におけるシグナル伝達経路や遺伝子制御機構については数多くの研究が行われている一方、個々の細胞が周囲の細胞とどのように同調して分化するのかはほとんどわかっていない。

以前の研究で、ドキシサイクリン非存在下(Dox-)においてプロテインキナーゼA(PKA)が構成的に活性化されるマウス胚性幹細胞(ESC)株、PKA-ESC を作製した。Dox-条件下でPKA を活性化すると、三胚葉分化、特に中胚葉細胞の出現が早期化される。このシステムは、他の細胞株に依存せず、PKA-ESC のみで細胞分化速度を操作することが可能である。

本研究では、PKA-ESC と、分化速度が野生型と変わらないコントロール ESC 株(Control-ESC)のキメラ凝集培養を行った。この実験系では、Dox-によって PKA-ESCのみが特異的に分化を促進することから、胚発生に似た3 次元条件下で、2 つのESC 集団の間で意図的に異なる分化速度を生じさせることが可能となる。

単独培養の場合、非活性化PKA-ESC(Dox+)および Control-ESC では分化誘導3.5 日時点で中胚葉マーカーFlk1 陽性率が全体の10%未満であったが、活性化PKA-ESC(Dox-)の Flk1 陽性率は 40%以上であった。キメラ凝集培養において、Dox-条件では、分化誘導2.5 日目からPKA-ESC 中にFlk1 陽性細胞の出現が誘発され、3.5-4.5 日目には約40%に達した。PKA-ESC の早期分化に追随するかのように、Control-ESC 集団にもFlk1 陽性細胞が出現し始め、分化誘導 3.5 日目までに PKA-ESC 集団の Flk1 陽性細胞の割合に追いついた。これを細胞形質同調と名付けた。

次に、細胞形質同調における細胞外小胞(Extracellular Vesicle, EV)の関連性を調べるため、キメラ凝集培養中に EV 分泌阻害剤である manumycin A を添加した。manumycin A 添加により、分化誘導3.5 日目においてDox-条件下にあるキメラ凝集体のうちControl-ESC 集団のみでFlk1 陽性細胞の出現が特異的かつ有意に減少した。次に、PKA-ESC から分泌された EV の影響を解析するために、非活性化 PKA-ESC(Dox+)、活性化PKA-ESC(Dox-)の分化培養上清を回収し、超遠心分離によってそれぞれEV(Dox+)、EV(Dox-)を単離した。Control-ESC に EV(Dox-)を添加すると、EV 無添加または EV(Dox+)よりもはるかに高い割合のFlk1 陽性細胞が誘導された。EV(Dox-)を胎生3.5日マウス胚に添加しex vivo 培養を行ったところ、典型的な自発的拍動を伴う心筋細胞が観察された(85 胚中11 胚)。

EV(Dox+)とEV(Dox-)に含まれるmiRNA の発現プロファイルをRNA-seq で比較し、EV(Dox-)に含まれるmiR-132 が細胞形質同調を担う情報伝達分子の1 つとして同定された。さらに、EV(Dox-)により受け手細胞に送達されたmiR-132 が標的となるSpry1、Rasa1 の阻害を介して下流の PKA シグナルを活性化し、結果的にPKA—ESC に形質を近づけることが示唆された。PLGA(ポリ乳酸・グリコール酸共重合体)を用いて、miR-132を含む PLGA ナノ粒子を作製し、胎生 3.5 日マウス胚に添加すると、EV(Dox-)添加時と同様に拍動する心筋細胞が観察され、EV 機能の模倣に成功した。

以上のように本研究は、EV を介した細胞間コミュニケーションによって、分化の過程で近接する細胞同士の形質が同調するという新たな生物学的現象を示した。

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参考文献

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