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Tissue factor pathway inhibitor‑2 is specifically expressed in ovarian clear cell carcinoma tissues in the nucleus, cytoplasm and extracellular matrix

太田 幸秀 横浜市立大学

2022.03.25

概要

1.序論
卵巣がんは先進諸国で最も死亡数が多い婦⼈科悪性腫瘍である.上⽪性卵巣癌は5つの主要な組織型に分けられ,癌の特性が⼤きく異なり,組織型診断が重要である.明細胞癌は欧⽶では稀だが,アジアでは発症頻度が⾼い.(Machida,2019）.明細胞癌は初回診断時にI期の5年⽣存率は85％であるが,Ⅲ,Ⅳ期ではそれぞれ35%,16%と予後不良である(Torreetal.,2018）.これは明細胞癌が化学療法抵抗性（Sugiyamaetal.,2000）で静脈⾎栓症を合併しやすい（Matsuuraetal.,2007）ことが理由としてあげられる.そのため早期診断の開発,新規薬剤の開発,⾎栓症メカニズムの解明が⼤変重要な課題である.

既存の卵巣がんの診断マーカーであるCA125は感度,特異度とも低く,明細胞癌の診断に⼗分とは⾔えない.横浜市⽴⼤学では明細胞癌の早期発⾒を⽬的として,⾎清診断マーカーの開発を⾏い,組織因⼦経路阻害因⼦-2Tissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2)を⾒出した（Arakawa,2013;Arakawa,2016）.

TFPI-2は分泌型セリンプロテアーゼ阻害タンパクで3つのクニッツ型ドメインと正電荷を持つC末端で構成され,胎盤に⾼発現する（Udagawaetal.,1998and2002）.TFPI-2は外因系⾎液凝固カスケード（組織因⼦経路）の起点となる組織因⼦（TF）と活性化型⾎液凝固第VII因⼦(FVIIa)との複合体（TF-FⅦa）に対する阻害作⽤は弱いが、プラスミンやトリプシン等のセリンプロテアーゼに対して強い阻害作⽤を持つ.多くの癌腫においてTFPI2遺伝⼦プロモーター領域のCpGアイランドのメチル化に伴い,遺伝⼦転写抑制を受ける.癌の浸潤,転移において,トリプシンやプラスミンによって活性化された複数のマトリックスプロテアーゼ（MMP）により細胞外基質が分解されるが、TFPI-2はトリプシン,プラスミンの作⽤を阻害することで,MMP-1,MMP-3の活性化を抑制し（Raoetal.,1999）,またMMP-2の産⽣を阻害することでも癌の浸潤,転移に対して抑制的に働く（Izumietal.,2000）.また,TFPI-2のC末端は核移⾏シグナルとして働き,TFPI-2は核内に取り込まれる（Kempaiahetal.,2009）,培養乳癌細胞に細胞外から組換え体TFPI-2を作⽤させると,TFPI-2が核に移⾏し,MMP2の遺伝⼦発現が抑制される（Wangetal.,2017）ことが報告されている.

本研究では患者⾎中で上昇するTFPI-2が明細胞癌の組織に由来するかを免疫組織化学により検討し,同時に病理診断マーカーとしての有⽤性を検討した.また,TFPI-2の細胞内局在を明らかにし,TFPI-2の発現が臨床情報とどのような関連があるかも検討した.

また,静脈⾎栓症の発症頻度が明細胞癌で多い理由として,TFPI-2のプラスミン阻害作⽤による線溶系抑制が関与していると仮説を⽴て,動物実験により検証した.

2.実験材料と⽅法
ヒト明細胞癌の細胞株11株を⽤いてTFPI-2の発現と細胞内局在をウエスタンブロット法で解析した.また,サンドイッチELISAの系を⽤いてConditionedmedium中のTFPI2濃度を測定した.

上⽪性卵巣癌の患者検体142例の組織切⽚をHE染⾊し,TFPI-2抗体clone28Aa(Ogawa,2008)とcloneB-7(SantaCruz)を⽤いて免疫組織化学染⾊を⾏なった.TFPI-2発現の評価は,核と細胞質はcloneB-7により染⾊し,⾃動解析ソフトによりHスコアを算定した.細胞外基質はclone28Aaにより染⾊し,陽性,陰性の判定を⾏った.TFPI-2の発現を組織型別に評価し,明細胞癌組織では,TFPI-2発現と臨床背景（診断時の年齢,分娩歴,閉経の有無,⾎清CA125値の上昇（>35U/ml）,FIGO分類,TNM分類）や予後（5年⽣存率）との関連について解析を⾏った.

また,CRSPAR/CAS9を⽤いて,明細胞癌細胞株ES-2のTFPI2遺伝⼦ノックアウト細胞株を樹⽴した（KO1,KO2）.免疫不全マウスの⽪下にノックアウトおよび⾮ノックアウト細胞株（SC）を移植し,3週間後に,下⼤静脈完全静⽌モデルまたは塩化鉄傷害下⼤静脈⾎栓モデルを⽤いて,誘発された⾎栓の重量を⽐較した.

3.結果
明細胞癌細胞株11種のうち8種（72％）（ES-2,TOV-21G,OVISE,OVMANA,RMG-1,HAC-2,JHOC-7,JHOC-9）でTFPI-2が発現していた.3つの細胞株（OVTOKO,JHOC-5,JHOC8）では発現がなかった.また,4種（OVMANA,RMG-1,JHOC-7,JHOC-9）は核,細胞質の両⽅に発現していた.Conditionedmedium中のTFPI-2濃度は,ウエスタンブロット法により解析した細胞外分画の発現量の傾向に⼀致していた.上⽪性卵巣癌組織切⽚の検討では,明細胞癌では核,細胞質,細胞外基質のいずれの分画でもTFPI-2が陽性となった.核,細胞質,細胞外基質のいずれかで陽性となるものは67.5%(52/77)であった.⼀⽅,⾮明細胞癌では1例もTFPI-2が陽性とならなかった（n=65）.TFPI-2の陽性の有無により,他の組織型から明細胞癌を感度67.5％,特異度100%で診断可能であった.TFPI-2発現の有無と,臨床背景や予後に関する解析を⾏なった.TFPI-2陽性では年齢が有意に若かった（56vs60.5歳,P=0.019）が,そのほかの因⼦では有意な差はなかった.

また,下⼤静脈完全静⽌モデルによる誘発⾎栓の重量評価では,SCと⽐較しKO2は有意に⾎栓重量が⼤きかった（P=0.0495)が,SCとKO1の間に有意差は認めなかった.塩化鉄傷害下⼤静脈⾎栓モデルでは細胞株間で誘発される⾎栓重量に有意差はなかった.

４．考察
本研究では組織標本を⽤いて明細胞癌組織でTFPI-2が発現していることをはじめて明らかにした.これはTFPI-2を卵巣明細胞癌の⾎清バイオマーカーとする上で重要な知⾒であると考える.また,免疫組織化学染⾊は⾼い特異度（100％）で明細胞癌と他の組織型の上⽪性卵巣癌との鑑別を⾏うことが可能であった.TFPI-2が細胞質,核,細胞外分画のいずれにも発現することを⽰し,これはTFPI-2の核内や細胞質内での役割を解明する上で重要な知⾒と考える.

本研究ではTFPI-2の⾎栓形成に与える効果を⽰すことはできなかった.⾎清中TFPI-2濃度は,⾮妊娠期は90pg/mL程度であるが,妊娠後期には最⼤では530ng/mL程度まで上昇する(Ogawaetal.,2008andVadiveletal.,2014).卵巣明細胞癌患者では最⼤でも5.5ng/mL程度であり(Miyagietal.,2021),妊娠時と⽐較して低値である.TFPI-2のプラスミン抑制作⽤により,⾎栓形成に影響があったとしても,その影響は⼩さい可能性がある.また腫瘍移植によって産⽣されたヒトTFPI-2がマウスのプラスミンをどれだけ阻害するかに関する⼗分な研究報告はなく,プラスミンを⼗分阻害できていない可能性がある.また,これまでの動物実験の⾎栓症評価モデルはいずれも,下⼤静脈結紮や,塩化鉄による⾎管内⽪の傷害など,癌に伴う⾎栓形成を⼗分に反映していないと考えられ,新規の担癌動物の⾎栓症評価モデルの開発が必要である.

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