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Establishment of a heart‐on‐a‐chip microdevice based on human iPS cells for the evaluation of human heart tissue function

Abulaiti, Mosha 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23752

2022.03.23

概要

【背景】
ヒト iPS 細胞由来心血管構成細胞から作製した細胞シートなどの三次元組織はヒト心臓機能を模倣しうる事から、疾患再現・創薬研究や心毒性評価にとって有用なツールになりうる事が期待されている。これまで、動画解析系や高感度ひずみセンサーを含む高度な機械工学的技術による収縮力評価系による細胞シート機能評価法が報告されているが、臨床外挿性に欠け、設備投資を要する等の問題がある。機能評価系の普及には、高汎用性・低コスト・高感度の系の構築が望ましい。従って本研究では、ハートオンチップ型マイクロデバイスを開発し、人工心臓組織の拍動機能を反映する粒子の変位の観察により検証した。

【方法】
微小電動機械システム(MEMS)ベースの微細加工技術によるジメチルポリシロキサン(PDMS)製のプッシュバー、チャンバー層、ダイアフラム膜層、マイクロチャンネル層を構成する事でマイクロ流体チップを設計した。ヒト iPS 細胞から心臓構成細胞を同時分化誘導し、温度感受性ポリマー(PIPAAm)を用いた培養皿に播種して細胞シートとして回収した後、１～２週間の動的流水培養トレニンーグにより、自己拍動を伴うマイクロ心臓組織を作製し、マイクロ流体チップのプッシュバー上に載せてハートオンチップ型マイクロデバイスを作製した。固定培養後に、マイクロチャンネル層に蛍光粒子を注入し、自己拍動を反映した各粒子の水平方向の前後の周期的変位を顕微鏡下で観察する事で、心筋シートの拍動の動態を可視化した。数値解析ソフトウェアのMATLAB を用いた自動多点粒子変位量で外部電気刺激（30V）に対する心臓組織の反応性及び粒子変位量の評価、定量化を行い、既報の動画解析による心筋シート収縮評価系と比較する事で検証した。また心筋収縮における生物学的応答である細胞内カルシウムイオン濃度の外部電気刺激に対する変動を、カルシウムイオンセンサー蛋白質である遺伝子（GCaMP）を導入したiPS細胞を用いてマイクロ心臓組織を作製し、カルシウムイメージングで確認した。更に代表的なβ作動薬である Isoproterenol を用いて、循環作動薬に対するデバイスの反応性を検討した。

【結果】
iPS 細胞由来細胞シートの動的流水培養により、内部に血管網を持つ、厚み150～200 ㎛ 程度の三次元的なマイクロ心臓組織を作製する事に成功した。外部電気刺激をデバイスに与える事により脈動周波数と粒子の変位距離および速度との間の強い負の相関を確認した（R2=0.971）。粒子変位量を基にした計算により、今までに報告されている心筋細胞シートの収縮力評価系と比べて２桁高い感度となる、0.01 ミリニュートン以下の微小な拍動力を検出できた。既報の画像解析系により検出された変位量あるいはカルシウムイオン濃度の変動と、拍動の外部電気刺激周波数において、デバイスと同様の負の相関を認め、本デバイスが心筋細胞の拍動およびカルシウムイオン濃度変化を捉えている事が示された。Isoproterenol による拍動数変化と変位距離も強い相関を示した（R2=0.978）。これらの結果により、ハートオンチップ型マイクロデバイスが、拍動の速さや強さ、細胞内カルシウムイオン濃度、薬理学的反応等において、生体の心臓機能を再現している事が示された。

【結語】
ヒト iPS 細胞由来心筋シート作製技術及びマイクロ流体チップ技術の融合により創薬や心臓毒性試験のための人工心臓組織の生理学的パラメーターを高感度に機能評価できるバイオアッセイ系を開発した。候補化合物を用いた本デバイスの更なる薬理学的検証により、心臓の難病に対する創薬研究や新規開発薬の心毒性評価に寄与すると期待される。

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