オリゴデンドロサイト前駆細胞の制御機構および病態時の機能に関する研究
概要
オリゴデンドロサイト前駆細胞の制御機構
および病態時の機能に関する研究
2022
大橋 佳奈
目次
緒言 ............................................................................................................................................... 1
第一章
初代培養 OPC における TRPV4 の機能解析 .......................................................... 4
方法 ........................................................................................................................................... 5
結果 ........................................................................................................................................... 9
考察 ......................................................................................................................................... 16
第二章
初代培養 OPC における TRPM3 の機能的発現 ................................................... 18
方法 ......................................................................................................................................... 19
結果 ......................................................................................................................................... 21
考察 ......................................................................................................................................... 25
第三章
自己免疫性脱髄病態における OPC の役割解明 .................................................. 28
方法 ......................................................................................................................................... 29
結果 ......................................................................................................................................... 32
考察 ......................................................................................................................................... 41
総括および結論 ......................................................................................................................... 44
謝辞 ............................................................................................................................................. 45
発表論文目録 ............................................................................................................................. 46
引用文献 ..................................................................................................................................... 47
緒言
中枢神経系のグリア細胞であるオリゴデンドロサイトは、髄鞘形成を行い神経伝導の高
速化を担う。髄鞘の維持は神経機能の保持に重要である。髄鞘異常は、加齢、多発性硬化
症や神経変性疾患などの病態時において広く認められるため、高齢化社会において増加し
ている中枢神経疾患の治療標的として今後さらに重要となるであろう。
オリゴデンドロサイト前駆細胞 (OPC) は成体脳細胞数の5%ほどを占め、増殖、病変部へ
の遊走、オリゴデンドロサイトへの分化を行い、髄鞘形成に寄与する。しかし、その機能
制御機構はほとんど解明されていない。また、病態時には、OPCの異常が髄鞘異常の一因
となることが示唆されているものの、その詳細な機能は不明である。従って、OPCの機能
制御機構および疾患時の役割解明は、中枢神経系の正常な機能や疾患メカニズム理解のた
めに重要である。
本研究の第一章、第二章では、OPC機能制御機構の一端を解明するために、Ca2+透過性
非選択的カチオンチャネルであるtransient receptor potential (TRP) チャネルのサブタイプ、
TRPV4とTRPM3に着目して研究を行った。これらのチャネルは、体温ほどの温かい温度域
や機械刺激、低浸透圧といった脳内の生理的刺激や病態刺激で活性化するが、OPCにおけ
る機能は不明であったため、Ca2+シグナリングおよび細胞機能への関与について検討を行
った。
第三章では、自己免疫性脱髄疾患である多発性硬化症(MS)におけるOPCの役割を、モデ
ルマウスを用いて検討した。OPCはオリゴデンドロサイトの前駆細胞としての役割から、
脱髄病態においても保護的に働くものと想定されている。しかし、MS患者やMSモデルマ
ウスでは、一部のOPCで炎症性因子の遺伝子発現が上昇しており、生理的なOPCとは異な
る性質を持つ可能性がある。しかし、病態モデルを用いた介入実験は未だされておらず、
OPCが従来の想定通り保護的に働くのか、それとも病態増悪に働くのかは不明である。そ
こで、MSモデルマウスにおいてOPCを病期特異的に除去することにより、OPCの病態形成
への関与を検討した。
本研究により得られた新規知見は以下の通りである。第一章では、初代培養OPCを用い
た検討により、TRPV4がOPCに発現し、その活性化により細胞内Ca2+流入とプロテインキ
ナーゼC活性化を介して細胞増殖が促進されることを明らかにした。第二章では、初代培
養OPCでTRPM3が発現し、その活性化により細胞内Ca2+流入が惹起されることを示した。
さらに、OPCのTRPM3は脳梗塞モデルや炎症条件下にて発現上昇し、病態時における機能
が示唆された。第三章では、多発性硬化症モデルマウスにおいて、予想に反し、OPCが急
性期の病態悪化や脱髄悪化に関与することを見出した。さらにその機序として、OPCが末
梢から浸潤したマクロファージを脊髄において活性化させ、T細胞の再活性化を促進する
ことが示唆された。
これらの研究成果について、以下に論述する。
1
なお、本文中および図中で使用した略語は以下の通りである。
AMPA
α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
BDNF
brain-derived neurotrophic factor
BrdU
bromodeoxyuridine
CC
corpus callosum
cDNA
complementary deoxyribonucleic acid
CD3
cluster of differentiation 3
CD4
cluster of differentiation 4
CD8
cluster of differentiation 8
CIITA
class II major histocompatibility complex transactivator
cRNA
complementary ribonucleic acid
CNS
central nervous system
CNTF
ciliary neurotrophic factor
CTX
cerebral cortex
DMSO
dimethyl sulfoxide
DTR
diphtheria toxin receptor
EAE
experimental autoimmune encephalomyelitis
FGF
fibroblast growth factor
FISH
fluorescence in situ hybridization
Fura 2-AM
Fura 2-acetoxymethyl ester
GFAP
glial fibrillary acidic protein
HEK
human embryonic kidney
Iba1
ionized calcium-binding adapter molecule 1
IFNγ
interferon γ
IL1β
interleukin 1β
IL17A
interleukin 17A
MBP
myelin basic protein
MHC
major histocompatibility comlex
MMP9
matrix metalloproteinase 9
MOG
myelin oligodendrocyte glycoprotein
MS
multiple sclerosis
NFAT5
nuclear factor of activated T cells 5
NF-κB
nuclear factor-kappa B
NG2
neuron-glial antigen 2
NMDA
N-methyl-D-aspartate
2
OPC
oligodendrocyte precursor cell
PBS
phosphate-buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
PDGF
platelet-derived growth factor
PDGFRα
platelet-derived growth factor receptor α
PDGFRβ
platelet-derived growth factor receptor β
PFA
paraformaldehyde
PKC
protein kinase C
PLP
proteolipid protein
PS
pregnenolone sulfate
P4
postnatal day 4
RNA
ribonucleic acid
RT-PCR
reverse transcription-PCR
rRNA
ribosomal RNA
TNFα
tumor necrosis factor α
TRP
transient receptor potential
TRPC1
transient receptor potential canonical 1
TRPM3
transient receptor potential melastatin 3
TRPV4
transient receptor potential vanilloid 4
TLR
toll-like receptor
T3
triiodo-L-thyronine
VEGF
vascular endothelial growth factor
3
第一章 初代培養OPCにおけるTRPV4の機能解析
オリゴデンドロサイトはグリア細胞の一種であり、神経軸索を髄鞘で覆うことで神経伝
導を高速化し、神経の代謝を助ける[1, 2]。オリゴデンドロサイト前駆細胞 (OPC) は、増殖、
遊走し、オリゴデンドロサイトに分化する。脱髄や白質傷害は、多発性硬化症、アルツハ
イマー病、精神疾患など、様々な中枢神経疾患において認められる[3, 4, 5]。そのため、
OPCの増殖、遊走、分化の制御は、これらの病態の改善につながる可能性がある。OPCの
増殖は、中枢神経系 (CNS) 傷害後の髄鞘修復の過程で最初におこる。多発性硬化症におい
て、OPCは傷害を受け、髄鞘修復が低下する[6]。また、OPCはオリゴデンドロサイトに分
化するだけでなく、脳由来神経栄養因子(BDNF) を産生し、神経をアポトーシスから保護
する役割も担う[7, 8]。したがって、OPC数を増やすことは、CNS傷害後の髄鞘修復や機能
回復を促進するための重要な戦略となりうる[9, 10]。
OPCの機能を制御する細胞内シグナリングは十分に解明されていないが、OPC機能に影
響を与える分子として、ソニックヘッジホッグ、Wntタンパク質、NMDA、血小板由来成
長因子 (PDGF)、線維芽細胞成長因子 (FGF)、ニューレグリン、BDNFが報告されている[11,
12, 13, 14, 15]。
また、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸(AMPA)受容体[16]、
P2Xプリン受容体[17]、電位依存性Ca2+チャネル[18]を介してOPCの細胞内Ca2+濃度が上昇
することが報告されており、これらの受容体やチャネルへの刺激は、OPCの増殖[18]、形
態[16]、分化や髄鞘形成[18]を制御する。さらに、PDGFやFGFはCa2+応答を惹起する[19]。
しかし、Ca2+シグナリングの詳細なメカニズムは未だ十分に理解されていない。
Transient receptor potential (TRP) チャネルは、多様な機能を持つCa2+透過性非選択的カチ
オンチャネルである。哺乳類では、28種類のTRPチャネル遺伝子が6ファミリー (TRPC,
TRPM, TRPV, TRPA, TRPP, TRPML) を構成している[20]。これまでに、OPCにおいては、
TRPC1活性化がストア作動性Ca2+流入を介して増殖を促進することが報告されている[21]。
また、髄鞘形成期の初期のオリゴデンドロサイトでTRPM3が発現し、活性化によってCa2+
応答を惹起する[22]。成熟オリゴデンドロサイトにおいて、プロトン作動性のTRPA1が機
能的に発現しており、TRPA1活性化によるCa2+応答は髄鞘傷害を引き起こす[23]。しかし、
他のTRPチャネルのオリゴデンドロサイト系譜細胞の機能への関与は未だ不明である。本
章では、温度刺激、低浸透圧、機械刺激、アラキドン酸代謝物などの様々な環境刺激で開
口するTRPV4のOPCにおける機能を解析した。その結果、TRPV4はin vivoおよび初代培養
系両方においてOPCで発現し、TRPV4選択的アゴニストGSK1016790A処置が、Ca2+流入や
プロテインキナーゼC (PKC) 経路を介してOPCの増殖を促進することを見出した。
4
実験方法
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) と免疫組織学的検討
FISHは、既報[24, 25]に従って行った。Trpv4, Pdgfra, プロテオリピドタンパク質 (Plp), グリ
ア繊維性酸性タンパク質 (Gfap) の相補リボ核酸 (cRNA) プローブは既報[24, 26, 27]に従っ
て作製し、ビオチンやジゴキシゲニンによるcRNAプローブの標識は、既報[25]に従って行
った。 8週齢マウス脳の矢状切片は、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、ビオチン標識
またはジゴキシゲニン標識cRNAプローブと反応後、洗浄した。ビオチンは、ペルオキシ
ダーゼ標識ストレプトアビジン(PerkinElmer; 1:100)と1 時間反応後に、フルオレセインイソ
チオシアネート-チラミドシグナル増幅キット(PerkinElmer)を用いて検出した。残存ペルオ
キシダーゼ不活化のために1.0% H2O2と30分間反応後、ジゴキシゲニンはペルオキシダーゼ
標識抗ジゴキシゲニン抗体(Roche Diagnostics;1:500)と1時間反応させた。Ionized calciumbinding adapter molecule 1 (Iba1)の検出には、抗Iba1抗体(1:500, Wako)およびAlexa Flour 564
標識ヤギ抗ウサギIgG (1:2000)を用いた。切片の観察には、冷却CCDカメラ(DP80, Olympus)
搭載の蛍光顕微鏡(BX53, Olympus)を用いた。
初代培養OPC
全実験は、京都大学動物実験委員会が定める倫理指針に従って行った。初代培養OPCは、
0–2日齢のWistar/STラット新生仔 (Japan SLC) の大脳皮質から調製した。まず、大脳皮質を
トリプシン (2.5 mg/mL; ナカライテスク) とDNase I (25 μg/mL; D5025, Sigma-Aldrich)で37
°C 15 分間処理して細胞を解離させ、ポリ-L-オルニチンでコーティングした75 cm2フラス
コに播種した。非働化した10%ウシ胎仔血清および 1%ペニシリン/ストレプトマイシン混
合液(ナカライテスク)含有ダルベッコ改変イーグル培地 (D5796, Sigma-Aldrich) 中で、
37 °C 5% CO2下で培養し、混合グリア培養を作製した。 10–15日後、OPC を単離するため
に、シェイカーでフラスコを120–130 rpmで1時間振とう後、ミクログリアを含む上清を取
り除き、新たな培地を追加した。その後、230–250 rpm で 16–18 時間振とうし、浮遊した
細胞を回収し、コーティングしていない10 cm ディッシュ上で 37 °C 5% CO2 で1時間培養
して張り付いたアストロサイトを除去し、上清の細胞懸濁液を、ポリ-L-オルニチンでコー
ティングされた 10 mm カバーガラス、35 mm ディッシュまたは 48 ウェル プレートに再播
種した。増殖培地として、1 × B27 (Life Technologies)、グルタミン (2 mM)、1%ペニシリン/
ストレプトマイシン混合液、血小板由来成長因子 (PDGF) -AA (10 ng/mL; PeproTech)、およ
び塩基性FGF (10 ng/mL; PeproTech)を添加したNeurobasal 培地 (Life Technologies) を用い、
細胞は播種から1日以上置いた後使用した。OPCの分化誘導には、トリヨード-L-チロニン
(T3, 30 ng/mL; Sigma-Aldrich)と毛様体神経栄養因子 (CNTF, 10 ng/mL; PeproTech)含有の分化
培地を用いた。
5
免疫細胞化学
OPCは、ガラスカバーガラス上にて増殖培地で2日間培養した。分化検討用には、分化培地
でさらに5日間培養した。細胞は4%パラホルムアルデヒド (PFA) 固定後、3%ウシ血清アル
ブミンと0.1%トリトンX-100含有リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で30分間透過処理した。1
次抗体と室温で3時間反応後、洗浄し、2次抗体と4°Cで一晩反応した。血小板由来成長因
子受容体α (PDGFRα) およびミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の検出には、以下の抗体を
用いた。1次抗体:ウサギ抗PDGFRα抗体 (1:1000; Santa Cruz)、ラット抗MBP抗体 (1:375;
Millipore) 。2次抗体: Alexa Fluor 594標識ロバ抗ウサギIgG (1:500;Invitrogen)、Alexa Fluor
488標識ロバ抗ラットIgG (1:500; Invitrogen)。DAPI Fluoromount-G (Southern Biotechnology
Associates)で核染色後、FluoView FV10i共焦点顕微鏡 (Olympus) を用いて蛍光画像を撮影し
た。
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)
35 mmディッシュで培養したOPCからの総リボ核酸 (RNA) 抽出には、Nucleo Spin RNAキッ
ト (TaKaRa Bio) を使用した。1本鎖相補デオキシリボ核酸(cDNA)は、ReverTra Ace qPCR
RTキット (Toyobo) を用いて調製した。ラットTrpv4 cDNAは、Blend Taq (Toyobo) を用い、
プ ラ イ マ ー ペ ア
(5 ′ -GGTTGTGTCTGCGGCGCTCT-3 ′ ,
5 ′ -
GTGGTGGCCCACTGCAGCTT-3′)で増幅した。94 °C 2分間反応後、 94 °C 30 秒間、58 °C
30 秒間、72 °C 1 分間の反応を30サイクル行った。増幅したPCR産物は、臭化エチジウム含
有アガロースゲルで電気泳動し、紫外線ライトで検出した。画像取得には、Quantity One
software (Bio-Rad) を用いた。
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、既報[28]に軽微な修正を加えて行った。2日間培養したOPC
は、RIPAバッファー (Nacalai Tesque)で溶解した。タンパクは、NuPAGE 4× LDS sample
buffer (Life Technologies)で希釈し、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル
にロードし、Immobilon-P PVDF transfer membranes (Millipore)にブロットした。Blocking
One (Nacalai tesque)によるブロッキング後、メンブレンは抗TRPV4抗体(1:250; ab39260,
Abcam)と0.1% Tween-20と10% Blocking One含有トリス緩衝生理食塩水中で 4°Cで一晩反
応させた。 ...