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グループBに属するリボヌクレアーゼコリシンの構造機能研究

張, 榮維 東京大学 DOI:10.15083/0002001679

2021.09.08

概要

バクテリオシンは細菌が生産するタンパク質毒素であり、同一ニッチにある他細菌に対する優位性獲得の手段として利用される。このうち、大腸菌およびその近縁細菌が有するバクテリオシンをコリシンと呼ぶ。コリシンは生産菌が持つColプラスミドにコードされており、同種のプラスミドを持たない他の感受性菌に作用する。コリシンの抗菌スペクトルは非常に狭く、生産菌と同種、あるいは近縁細菌にのみ作用するが、この点で抗生物質や他の生物毒素と異なる。コリシンDはColDプラスミドにコードされた697アミノ酸からなる毒素タンパク質であり、そのC末端に存在するRNaseドメイン(C-terminal RNase Domain, CRD)が感受性菌のtRNAArgを特異的に切断する。コリシン生産菌は、自身が生産したコリシンによる「自殺」を防ぐために特異的な免疫性遺伝子を持つ。コリシンDの免疫性遺伝子にコードされるタンパク質ImmDは94アミノ酸からなり、CRDとヘテロダイマーを形成することでその活性を阻害する。大腸菌には4種類のtRNAArgが存在するが、コリシンDはこれらのアンチコドンループの3末端を特異的に切断し、タンパク合成を阻害する。生産菌から放出されたコリシンは、感受性菌の細胞表層に存在する特異的レセプター及びインポートシステムを経由して細胞内へと侵入する。このインポートシステムとして、TolA, TonB及びこれに付随するシステムが利用されるが、TolAに依存するものはグループAに、TonBに依存するものはグループBに大別される。本研究で主な対象としたコリシンDはグループBに属しており、鉄の取込みに関わる外膜レセプターFepAに結合し、TonBシステム(TonB, ExbB, ExbD)を経由して細胞内に取り込まれた後、CRDが切り出されて細胞質内へと透過し、標的tRNAに作用する。

コリシンDは、N末端よりtranslocationドメイン(NTD、約310アミノ酸)、centralドメイン(CD、約280アミノ酸)、CRD(約100アミノ酸)の3つのドメインから構成される。このうちNTDは、コリシンBのN末端領域と高い相同性を示す(配列同一性95.2%)。コリシンBは感受性菌内膜にイオンチャンネル孔を形成する活性を持つが、コリシンDと同じグループBに属しており、NTDの相同性から、両者の外膜透過経路は同一であると考えられる。また、コリシンB全長の結晶構造が決定されたことから、構造生物学的な理解が可能となった。一方、コリシンDの内膜透過にはCDが関与すると考えられるが、その経路については多くの不明な点が残されていた。その理由の一つとして、これまでの議論が生化学的実験のみに基づいていたことが挙げられた。コリシンDに関しては、CRDとImmDの複合体結晶構造が得られているのみで、CDの構造は未解明であった。そこで、本研究は、コリシンDの全体構造を決定することで、コリシンDの膜透過経路および個々のドメインの機能を明らかにすることを目的とした。また、コリシンDのtRNAArg選択性と反応機構を構造生物学的に明らかにするために、CRDとtRNAとの共結晶構造解析も試みた。更に、コリシンDによるtRNA切断を介した細胞死誘導機構についても検討を行った。

第1章全長コリシンDの構造解析
本章では、コリシンD全長タンパク質を用いて様々な条件で結晶化実験を行ったが、低分解能(8.3Å)のX線回折を示す結晶しか得られなかった。全長コリシンD結晶の分解能が低い理由の一つとして、分子全体が細長い構造をとるため、ドメイン配置が結晶格子内にコンパクトにおさまらないことが考えられた。そこで、コリシンBと高い相同性を示すNTDを欠失させることで、分解能が高い結晶が得られると期待した。

第2章コリシンD313(CD-CRD)及びNTDの構造解析
コリシンDのNTDを欠失した313-697アミノ酸領域のコンストラクト(コリシンD313)を作製し、結晶化を行った。その結果、硫酸アンモニウムとPEG400を沈殿剤として用いた条件で分解能1.85Åのnativeデータセットが得られた。そこで、次にSe-SAD法を用いた位相決定を試みたが、野生型コリシンD313ではSeMet置換体結晶が成長しなかった。これは、N末端に連続してMetが存在するためと考え、これらを置換した三重変異体(M344K/M345A/M352L)を用いてSeMet置換体結晶を作製し、位相決定を行った。一方、NTD(1-321アミノ酸領域)のみでも結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。本研究で決定したコリシンD313の結晶構造はNTDを欠失しているが、コリシンBのNTDとの類似性を利用することで、コリシンDの全体構造を推定した。コリシンDとコリシンBは、共に感受性菌の外膜に存在するFepAレセプターを利用して感受性菌のperiplasmに侵入する。コリシンBの構造は2つのドメインに分けられ、両ドメインは一本の長いヘリックスで繋がれたダンベル状構造をとる。コリシンD313の結晶構造を解析した結果、N末端の313-330アミノ酸領域が、コリシンBの長いヘリックスの一部に相当しており、両者はよく重なることが分かった(18個のアミノ酸のCαのroot mean square deviation=0.262Å)。これを踏まえ、コリシンDのNTDをホモロジーモデリングにより構築した後、このヘリックス部分を通してコリシンD313の構造に重ねることで、コリシンD全長(NTD、CD、CRD)の推定構造を得た。更に、すでに決定されていたCRDとImmDの複合体結晶構造を利用することで、コリシンD全長-ImmDヘテロダイマーの全体構造の推定に成功した。

全長コリシンDの構造を用いて、感受性菌への透過経路を以下のように推定した。まず、NTDは外膜に存在するFepAレセプターに結合し、そのバレル状のトンネル内を通過する。この際、コリシンDのN末端のTonBbox配列(17-21アミノ酸領域にあるHSMVV)が内膜のTonBタンパク質に結合し、内膜のプロトン駆動力を利用することで、periplasmへと移行する。この過程でImmDがCRDから解離し、膜外に残ると考えられる。また、本研究により、CDには大部分がdisorderした長いループ状構造(413-436アミノ酸)をとる領域が存在することが分かった。以前の報告から、この領域は内膜に存在するシグナルペプチダーゼLepBと相互作用することで、内膜透過を促進することが示唆されていた。この領域がフレキシブルなループ構造をとることで、LepBとの相互作用を容易にしていると考えられる。また、LepBに捕えられたコリシンDのCRDが細胞質に到達する際に、内膜のAAA+プロテアーゼであるFtsHによりCDとCRDの間(589-590アミノ酸領域)が切断されることが報告されていた。本研究により、589-590の部分はCD構造の内部に位置することが判明したことから、FtsHによる切断には、この領域の部分的なunfoldingが必要であることが分かった。

第3章コリシンD/tRNA複合体のX線結晶構造解析
アミノアシルtRNA合成酵素は、tRNAの3’末端にアミノ酸を付加する機能を持ち、tRNAを特異的に認識する酵素の代表例である。一方で、コリシンDのCRDの分子量は約12,000であり、同一tRNAを認識する大腸菌ArgRS(分子量:約65,000)に比べると分子サイズは小さいが、高い基質特異性を示す。分子の大きさから考えれば、CRDはArgRSのようにtRNA全体を認識することは不可能であり、切断部位であるアンチコドンループ近傍の塩基、或いは構造を認識すると予想される。これまでの生化学的実験結果から、アンチコドン3文字目のGおよびDループ上の塩基が切断効率および基質認識に影響することが示されているが、認識機構の完全な解明には至っていない。そこで、本章では、コリシンDとtRNAとの共結晶の取得を試みた。結晶性を向上させるために、N末端長を変化させた様々なコリシンDを用いた。また、基質tRNAについても、コリシンDによる切断を受けづらくするために塩基置換を施すなどの工夫を試みたが、結晶化には至らなかった。この原因の一つとして、コリシンDのtRNA切断活性が非常に高く、tRNAと安定した複合体構造を維持できないことが考えられた。そこで、触媒残基を変異させた変異型コリシンDも用いたが、共結晶は得られなかった。また、変異導入によりタンパク溶解度が大幅に低下したものもあり、こうしたことも結晶化出来なかった原因に挙げられた。

第4章tRNAの切断と細胞死誘導との関係の解析
tRNAは細胞にとって必須の因子である。従って、コリシンDによるtRNA切断は、感受性菌の速やかな細胞死を誘導すると考えられていた。これは、コリシンDを短時間作用させただけで、感受性菌のコロニー形成能が顕著に低下することからくる「印象」も影響していると思われる。しかし、コロニーを形成しないことが細胞の「死」を意味するとは限らない。すなわち、tRNAが切断された感受性菌は、生きてはいるがコロニー形成能を失っている可能性もある。これに対し、温度感受性コリシンDを用いて任意の期間だけ感受性菌のtRNA切断を行うことで、少なくとも4時間は感受性菌の静菌的生育停止が観察されることが示されていた。そこで、これを担う因子を調べたところ、tmRNA及びSmpBが必要であることが分かった。これらの因子は、mRNA上で異常停止したリボソームのレスキューシステムであるtrans-translationを構成する。更に、この結果を補強するために、野生型コリシンDを作用させた感受性菌の生死を、LIVE/DEAD染色により調べた。その結果、tRNA切断特異的に静菌的生育停止が誘導されること、これにはtrans-translationが必要であることがあらためて示された。コリシンDやE5の生産菌集団は、他の大腸菌集団の生育を抑制しつつ、その間に自らの集団の細胞数を増やし、優位性を確保している可能性がある。

総括
本研究では、コリシンDのCD-CRDの結晶構造を決定し、これを用いて全長コリシンDの立体構造モデルを構築した。特に、CDの立体構造を初めて決定したことにより、内膜透過に関わる因子と相互作用する領域の構造的特徴を明らかにした。コリシンDのCDのcore foldは、グループAやグループBコリシンのN末端に存在するtrans locationドメインと似ていたことから、これらのドメインは共通のタンパク質を祖先に持ち、細菌の外膜及び内膜に存在する様々なタンパク質をハイジャックすることで透過機能を持つように分子進化してきたと予想された。更に、全長コリシンDの構造から、感受性菌の外膜と内膜を通過して最終的にCRDが細胞内に到達する経路を推定することができた。CRDが細胞内のtRNAArgを特異的に認識・切断する機構の構造基盤の解明には至らなかったが、一方でCRDの活性により引き起こされるタンパク質合成の阻害が感受性菌に与える影響の一端を明らかにすることができた。すなわち、tRNAを切断された大腸菌は直ちに細胞死には至らず、一定時間はtrans-translationに依存して静菌的に生育を停止することが分かった。tRNA切断によりコロニー形成能が低下することから、最終的には死菌となると考えられる。あるいは、生きてはいるがコロニーを形成出来ない状態へと移行する可能性もある。本研究により明らかにした、コリシンDの感受性大腸菌への侵入経路およびCRDの高い基質特異性に関する知見は、他のコリシン様バクテリオシンの作用機構解明にも貢献できると考えられる。更に、大腸菌感染症に対する治療など、臨床方面への応用も期待される。

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石田亘修士論文(2001) コリシン D の活性ドメインの同定と酵素学的解析

酒井英子卒業論文(2012) tRNA 切断に対する細胞の恒常性維持を担う因子の探索

高橋一敏博士論文(2008) リボヌクレアーゼ型トキシンの構造と機能の研究

高橋聖矢修士論文(2011) tRNA 特異的リボヌクレアーゼコリシン D の酵素学的解析

寺本和矢卒業論文(2013) コリシン D の tRNA 切断機構の解明

妻鳥奈津子修士論文(2007) tRNA 特異的リボヌクレアーゼ、コリシン D の作用と大腸菌の細胞応答

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