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Introduction and utilization of a gene targeting system in a basidiomycete Pleurotus ostreatus using CRISPR/Cas9 genome editing technology

BOONTAWON, TATPONG 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23521

2021.09.24

概要

白色腐朽菌は、植物細胞壁中のリグニンを効率よく分解できることから、自然界における木質バイオマスの循環において極めて重要な役割を担っており、木材分解メカニズムの解明と応用プロセスへの適用を目的として様々な研究がなされている。一方で、白色腐朽菌がリグノセルロースを構成する各成分を分解する際に分泌する多様な分解酵素遺伝子群の複雑な発現制御とその分子メカニズムについては、不分明な点が多く残されている。ヒラタケは、効率のよい形質転換法や比較的よく整備されたゲノム情報が備わっていることから、近年白色腐朽菌によるリグノセルロース分解系の研究におけるモデル生物として用いられている。さらに、世界中で栽培される食用担子菌でもあり、様々な生理活性物質を生産することも報告されてきた。このようなヒラタケの持つ微生物資源としての特色をより深く理解し、また有効に利用するためには、従来の遺伝学的な実験方法に加え、より広くまた自由にゲノム上の遺伝子配列を改変できる技術の開発が望まれている。

本論文では、第一章でCas9タンパク質とガイドRNAをコードする組換えプラスミドをプロトプラストに導入する事で、ヒラタケゲノム上の標的遺伝子(pyrGおよびfcy1)に挿入や欠失変異を効率よく導入して遺伝子機能を破壊(ノックアウト)することができることが示された。その際に、複数のガイドRNAによるゲノム編集効率を比較したところ、ガイドRNAの配列によって標的遺伝子を破壊する効率に差がある事が示された。さらに、標的部位近傍の配列と相同な配列をアーム領域として持つドナーDNAを同時にプロトプラスト内に導入する事で、ゲノム上の標的部位周辺がドナーDNA由来の配列と置換した形質転換体が多数単離できることを明らかにした。この結果は、 CRISPR/Cas9によって引き起こされた標的部位における二本鎖切断に引き続き、相同組換えに依存したDNA修復反応が起こり、効率よく標的部位を含む領域のDNA配列を置き換える事が可能になったものと推察された。この標的遺伝子挿入(ノックイン)の効率は、アーム部分の長さに依存しており、0.2, 0.5および1 kbの3種類の長さのアームを用いて検討したところ、0.5 kb以上の長さがあれば70%程度の効率で標的遺伝子の置き換えができる事が明らかにされた。

第二章では、前章で開発されたCRISPR/Cas9を用いた遺伝子ノックアウト法を用いて、ウシグソヒトヨタケを用いた従来の研究から二核化に必要なことが予想されている2つの遺伝子pcc1およびclp1について、ヒラタケを材料とした遺伝子破壊を行って、ゲノム編集によるノックアウト法の有用性を検証した。まず、これら2つの遺伝子のヒラタケでの発現についてリアルタイムPCRによる転写発現解析を行った。その結果、双方の遺伝子とも単核菌糸体では発現量が低く、二核菌糸体でのみ高い発現を示すことが明らかにされた。この結果は、従来ウシグソヒトヨタケで報告されている結果とよく一致している傾向を示した。次に、これらの遺伝子を標的とするガイドRNAを設計し、前章で構築した組換えプラスミドに挿入したものを、それぞれヒラタケのモノカリオン株に形質転換導入し、ゲノムPCR実験による解析を用いて標的遺伝子に大きな挿入が入り遺伝子機能が破壊されたと考えられる株を複数単離した。単核菌糸体のPopcc1破壊株では、ウシグソヒトヨタケでの報告とは異なり、シュードクランプが観察されないことが明らかにされた。一方で、交配により作成された二核菌糸体では、pcc1が破壊されているとシュードクランプが形成されることが観察された。一方、clp1破壊株では、交配させてもクランプが観察されず二核化が阻害されていることが示唆された。これらの結果からは、pcc1およびclp1はAgaricomyceteにおいて二核化やクランプを介した核の移動に必須であるが、それぞれの種において機能に一定のバリエーションがあり得ることが示唆された。

第三章では、外来DNAの染色体への残留を避けるため、Cas9タンパク質とガイドRNAの複合体(Cas9 RNP)を直接ヒラタケ細胞内に導入するゲノム編集が試された。試験管内で事前に会合されたCas9タンパク質とpyrG遺伝子を標的としたガイドRNAの複合体を、ヒラタケの単核菌糸体由来のプロトプラストに導入したところ、pyrG 遺伝子が破壊されたことによる5-フルオロオロチン酸耐性を示す変異株が複数単離された。これらの株について、ゲノムPCRおよびそれに続く塩基配列決定による解析を行ったところ、小さな挿入もしくは欠失変位を持つ事が明らかにされた。この結果は、 RNPを用いたゲノム編集がヒラタケおよび他の担子菌類でも利用可能なことを示唆するものである。さらに、外来DNAの挿入の可能性がないため、遺伝子組換えに該当しないゲノム編集の実現にとっての第一歩となる結果であると言える。一方、このRNPを用いたゲノム編集技術とsplit-marker法を組合せることによって、ゲノム上の標的遺伝子にマーカー遺伝子を挿入する事が可能なことが明らかにされた。従来多くの糸状菌では、一般に相同組換えの頻度が低く、遺伝子ターゲッティングを実施するには、非相同末端修復系に欠損を持つ特定の変異株を単離して、この株を宿主とすることが必要であった。しかし、本研究で開発された遺伝子ターゲッティング系は、野生型のバックグラウンドでの効率的な遺伝子のノックイン、ノックアウトを可能にするものである。

これらの研究結果により、本論文は白色腐朽菌であり、重要な食用担子菌でもあるヒラタケに初めてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を導入し、標的遺伝子のノックアウト、ノックインを可能にしたものであり、今後同様な方法を使ってヒラタケもしくはその他の担子菌類において、基礎および応用研究を推進させる基盤技術を開発したものである。

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