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タンパク質スキャフォールドSPINK2を用いたMMP-9特異的阻害剤の創製に関する研究

矢野, 秀法 筑波大学 DOI:10.15068/0002002148

2021.12.03

概要

1. モダリティーの多様化とその特徴
　近年、ゲノムやトランスクリプトーム、プロテオーム等、各種オミックス解析技術の進歩により、疾患におけるバイオマーカーの同定や疾患原因分子の推定が容易になりつつある。疾患の分子メカニズムを深く理解し、治療薬の開発を成功させるためには、標的分子に対して特異的に作用する化合物（アゴニストやアンタゴニスト）を迅速に創製することが求められている（Figure1-1）。
　標的分子を特異的かつ強力に認識することが可能なタンパク質性のモダリティーとして、抗体が挙げられる。その特長を活かして、抗体はin vitroおよびin vivo実験において疾患原因分子の検証用ツールとして汎用されている。検証の過程で見出された特定の抗体が、その疾患の医薬候補品となることもあり、これまでに多くの抗体医薬品が上市されている[1–4]。近年では、抗体の取得技術および改変技術の発展により、標的分子を同定後に医薬候補品を創製するまでの期間が短縮されている。さらに、抗体薬物複合体[5–8]や二重特異性抗体[9,10]に代表される抗体の高機能化によって、これまで達成できなかった新規の作用機序を持つ抗体医薬も開発されている。このように多くの医薬候補品創製に用いられている抗体であるが、未だにいくつかの課題を抱えている。例として、哺乳類細胞を用いた生産プロセスが高コストであること、生体での組織浸透性が低いこと、溝やポケット構造の認識が難しいこと、等が挙げられる（Table1-1）。
　抗体と異なるモダリティーとして、様々なタンパク質スキャフォールドが報告されている[11–14]。スキャフォールドの一部のアミノ酸配列をランダムに変異させたライブラリーから、標的分子に結合するクローンをスクリーニングすることにより、抗体と同様に標的分子を特異的かつ強力に認識する化合物を取得することが可能である。タンパク質スキャフォールドをモダリティーとする医薬候補品のうち、いくつかは既に臨床試験において使用されており、上市を目指した開発が進められている[11,15]。これらのスキャフォールドの分子量は抗体（およそ150kDa）と比較して極めて小さく（10kDa未満）、微生物宿主を用いた生産が可能、熱安定性が高い、組織浸透性が高い、等の特長を示す。しかしながら、報告されているタンパク質スキャフォールドの多くは、抗体と同様に標的分子の溝やポケット構造の認識が難しいという課題を抱えている（Table1-1）。
　疾患原因分子の生化学的活性に重要な活性中心領域は、多くの場合、タンパク質の立体構造上、溝やポケット構造を構成する。任意の溝やポケット構造を認識する化合物を確実に取得できることは、疾患原因分子の検証用ツールや医薬候補品の迅速な創製に繋がる。実際に低分子医薬候補品の多くが溝やポケット構造を認識しており、低分子化合物は活性中心領域を認識する化合物を創製する上で有用なモダリティーである。しかしながら、活性中心領域は一般的に配列保存性が高いこと、低分子化合物は分子量がおよそ500以下で標的分子と相互作用可能な表面積が小さいことから、標的分子特異的にその活性中心領域を認識する化合物を取得することが難しい（Table1-1）。

2. SPINK2の開発
　我々は先行研究において、標的分子の溝やポケット構造を特異的に認識するタンパク質スキャフォールドとしてserine protease inhibitor Kazal type 2（SPINK2）を開発した[16]。野生型のSPINK2はトリプシンやアクロシンといったセリンプロテアーゼを阻害する[17]。先行研究では、トリプシンとの相互作用に関わるループ部分のアミノ酸配列をランダムに変異した変異SPINK2（engineered SPINK2）をデザインし、それらを提示するファージディスプレイライブラリーを構築した[16]。この変異SPINK2ライブラリーに対して、キモトリプシンやkallikrein related peptidase 1、4、8（KLK1、4、8）といったセリンプロテアーゼをベイトタンパク質として用いたバイオパニングを実施し、標的プロテアーゼを阻害する変異SPINK2クローンをスクリーニングした。その結果、野生型SPINK2の標的であるトリプシンは阻害せず、標的プロテアーゼを特異的かつ強力に認識して阻害する変異SPINK2クローンを複数取得することができた。さらに、阻害クローンK41043とKLK4との複合体結晶のX線構造解析結果から、K41043がKLK4の活性中心に加えて、その周辺の広い範囲を認識して結合することが示された。
　SPINK2は、セリンプロテアーゼの活性中心の特異的認識に強みを持つことに加えて、他のタンパク質スキャフォールドと同様に、抗体と比較して極めて分子量が小さい（およそ7kDa）ため高い組織浸透性が期待できる、微生物宿主を用いた生産が可能、熱安定性が高い、等の特長を持つ[16]。したがってSPINK2は、低分子化合物はもとより、抗体やこれまで報告されているタンパク質スキャフォールドとも性質の異なる、新規の創薬モダリティーになり得ると期待される（Table1-1）。

3. 創薬標的としてのプロテアーゼ
　プロテアーゼはその活性中心の基質分解機構の違いから、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ等に分類される。マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases：MMPs）は、細胞外マトリックスタンパク質（例：コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等）の分解や、サイトカインおよびケモカイン（例：IL-1β、IL-8等）のプロセシング等に寄与し、細胞増殖や分化、遊走、アポトーシス等、多くの重要な生理機能に関与するメタロプロテアーゼである。MMPsの異常な発現や活性化は、炎症や癌転移等の病態を引き起こすことが報告されている[18,19]。これまでヒトにおいては23種類のMMPsが報告されており、いくつかのMMPsは、炎症性大腸炎等、細胞外マトリックスタンパク質の異常な分解が生じる疾患において亢進することが知られている[20,21]。疾患の発症や病態の進展における個々のMMPの役割をより深く理解するために、標的MMPのプロテアーゼ活性を特異的に抑える阻害剤の創製が強く求められている。
　MMPsの活性中心（active site）は、グルタミン酸残基と、亜鉛イオンを配位する3つのヒスチジン残基から成る。MMPsの活性中心の配列モチーフHEXGHXXGXXHはMMPsファミリー分子間で高度に保存されている。MMPsは基質分解活性を持たないpro-form（pro-MMPs）として翻訳、分泌される。Pro-MMPsにおいて、活性中心およびその周辺の溝構造の領域（active-site cleftと定義）はプロペプチドによって完全にマスクされ、基質と活性中心との相互作用は妨げられている[21]。Pro-MMPsの活性化は、酵素（例：プラスミン、トリプシン、他のMMPs等）による切断[22,23]や非酵素的な修飾[24–26]によってプロペプチドが除去され、active-site cleftが露出することによって生じる。
　MMPsは共通の基質切断モチーフ（P3サイトのプロリン残基およびP1′サイトの疎水性残基）を示すが、これはactive-site cleftの高い配列相同性に起因するものである[27,28]。一方で、高分子のタンパク質基質に対してはそれぞれのMMPが一定の基質特異性を示す[20]。この理由は、高度に保存された活性中心だけでなく、活性中心から離れた別の部位（exositeと定義）もまた基質認識に関わっているためと推測される。例えば、MMPsのいくつかのドメイン（MMP-1、-8、-13、-14におけるヘモペキシンドメイン、MMP-2および-9におけるフィブロネクチンドメイン（Fn-like domain））は高分子基質であるコラーゲンの分解に必須である[29–31]。保存性の高い活性中心と比べて、これらのドメインには一定の配列多様性がある。MMPsにおいては、これらのドメインが高分子基質の認識におけるexositeとして機能し、基質切断部位と活性中心との空間的位置関係が適切に制御され、特異的な高分子基質分解に寄与していると考えられている。
　MMPsの基質分解活性は、活性中心に結合する阻害剤によって完全に阻害される。そのような作用機序を示す阻害剤は“active-site inhibitors”と呼ばれ、ヒドロキサム酸誘導体を中心にこれまで60種類以上の低分子化合物が報告されている[32]。これらの阻害剤の多くはactive-site cleftにある活性中心の亜鉛イオンに配位することによって強力な阻害活性を示す。しかしながら、活性中心およびactive-site cleftといった保存性の高い領域のみしか認識できないため、MMPsファミリー分子全般に対して広範な阻害活性を示す。このような低分子の非特異的MMPs阻害剤のうちいくつかは、抗がん剤開発を目的とした前臨床試験で有望な薬理作用を示して臨床試験に進んだものの、広範な阻害活性に起因する筋骨格系疼痛や炎症等の重篤な有害事象を示し、それらの開発は中止されている[33]。臨床応用の観点でも、MMPsに対する特異的なactive-site inhibitorsは強く求められている。
　低分子化合物よりも相互作用面積が大きく、高分子基質と同様に活性中心とexositeの両方を認識可能なタンパク質性のactive-site inhibitorsも複数報告されている。抗MMP抗体SDS3およびSDS4は、MMPsの活性中心を模倣した低分子化合物を免疫原として取得された。それらはMMP-9の活性中心に結合し、強力な阻害活性を示すactive-site inhibitorsである。しかしながら、それらはMMP-9と配列相同性が最も高いMMP-2も阻害してしまうため特異的阻害剤とは呼べない[34]。一方、元々広範なMMPs阻害活性を持つタンパク質から、タンパク質工学を駆使して特異的なactive-site inhibitorsを創製する試みもある。内在のメタロプロテアーゼ阻害タンパク質であるtissue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs）は、活性中心の亜鉛イオンと相互作用することにより、強力かつ非特異的なMMPs阻害活性を示す[35]。MMPsのexositeと相互作用する残基にランダム変異を導入してスクリーニングにより取得した改変TIMPsは、特定のMMPsに対する特異性が向上している[36–38]。しかしながら、単一のMMPに対してのみ特異的な阻害活性を示す改変TIMPsの創製は難しく、未だ成功例は報告されていない。抗体取得技術やタンパク質工学技術の発展にも関わらず、MMPsの保存性の高い溝やポケット構造を特異的に認識する分子を創製することには未だ技術的課題がある[39]。
　MMPsの中でもMMP-9はIV型コラーゲンやゼラチン、エラスチン等を含むECMタンパク質の分解に寄与している[26]。MMP-9によるECM等の物理的バリアの破壊は、癌転移や炎症反応の促進に繋がる[18,32,40]。さらに、MMP-9の異常な活性は、多発性硬化症、脳卒中、てんかん、脳腫瘍、アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患に関与する血液脳関門の破壊を引き起こす[41,42]。MMP-9阻害剤がいくつかの病態モデルにおいて有望な薬理作用を示すことが報告されているが[43–46]、他のMMPs阻害剤と同様に、より高い阻害活性と特異性を併せ持つMMP-9阻害剤の創製が求められている[32]。
　本研究では、MMP-9を標的分子として選択し、変異SPINK2ライブラリーからメタロプロテアーゼMMP-9に対する特異的阻害剤を創製した結果を第2章にまとめた。次いで第3章では、MMP-9のアミノ酸配列および三次元構造情報を基に、酵素学的手法を用いて、取得された阻害剤がMMP-9を特異的に認識する機構を明らかにした。SPINK2がセリンプロテアーゼとは異なる溝やポケット構造を持つメタロプロテアーゼに対しても特異的阻害を達成したことで、SPINK2を用いた創薬研究の発展性が示唆されたことから、第4章にて今後の展望を考察した。

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