リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「Effects of BMP7 Produced by Group 2 Innate Lymphoid Cells on Adipogenesis」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

Effects of BMP7 Produced by Group 2 Innate Lymphoid Cells on Adipogenesis

宮島 優里奈 横浜市立大学

2020.05.31

概要

1. 序
免疫反応は自然免疫と獲得免疫に大別されるが、抗原特異的受容体を持ち獲得免疫に働くT細胞、B細胞、NKT細胞に対し、抗原特異的受容体を発現せずサイトカイン*により活性化され、自然免疫に働く自然リンパ球(Innate Lymphoid Cell; ILC)が近年注目を集めている。自然リンパ球は、細胞内細菌感染の排除に働くTh1細胞、寄生虫感染やアレルギー性疾患に働くTh2細胞、細胞外細菌感染の排除や上皮バリアの恒常性維持に働くTh17細胞に対応するように、1型自然リンパ球(Group 1 ILC; ILC1)、2型自然リンパ球(Group 2 ILC; ILC2)、3型自然リンパ球(Group 3 ILC; ILC3)に分類され、その分化、機能に重要な転写因子や、産生するサイトカインを共有する(図1)。
ILC2は、茂呂らが2010年に報告したナチュラルヘルパー(Natural Helper; NH)細胞を含む細胞群で(1)、他の成熟免疫細胞が発現するLineageマーカー(CD3ε, CD4, CD8α, CD11c, CD19, TCRβ, TCRγδ, B220, NK1.1, Mac-1, Gr-1, FcεRIα, TER119)を発現せず、IL-2、IL-7、IL-25、IL-33などのサイトカインに対する受容体を発現する。所属研究室はこれまでに、ILC2が寄生虫感染時やアレルギー性炎症時に産生されるIL-25やIL-33に反応し、既知の細胞と比較して多量の2型サイトカイン(IL-5、IL-13)を産生することで好酸球浸潤や杯細胞過形成を誘導し、寄生虫の排除やアレルギー性炎症の悪化に働くことを明らかにしてきた(1)。また、IFN、IL-27などの1型サイトカインがILC2の増殖、サイトカイン産生を抑制することを見出し、ILC2が引き起こす炎症の収束メカニズムも明らかにしている(2)。
一方、ILC2がamphiregulinを産生し組織の修復に働くことや(3)、ILC2からのIL-13がLgr5+の小腸上皮幹細胞の分化を促進することが近年報告され(4)、発見当初考えられてきた2型免疫応答のみならず、炎症の鎮静化や細胞の分化といった生体内の恒常性維持に重要な役割を果たす可能性が見出されている。さらに、ILC2は脂肪組織、肺、肝臓、皮膚、骨髄などの組織に常在するいわゆるtissue-residentな細胞であることが明らかとなっており、各組織で独自の機能を有する可能性も示唆されている。
ILC2が発見された腸間膜脂肪組織は、他の組織に比べて最も多くのILC2が存在する(1)。しかしながら、肺や腸管のILC2がアレルギーや寄生虫感染時に働くことは周知の事実となっているものの、なぜILC2が脂肪組織に多く存在するのかは未だ明らかでない。そこで本研究では、脂肪組織のILC2が恒常的に脂肪組織に対して与える影響を明らかにすることを目的とし、解析を行った。


2. 実験方法
1) 実験動物
C57BL/6Nマウスはチャールズリバー社より購入した。Bmp7flox/floxマウス（Regeneron Pharmaceuticals Inc Aris. N. Economides氏から京都大学柳田素子先生経由で譲渡）、Roraflox/floxマウス(理化学研究所生命医科学研究センター小安重夫先生、古関明彦先生、小原収先生、かずさDNA研究所中山学先生より譲渡）、Vav1-iCreマウスおよびCre-ERT2マウス（Jackson Laboratoryより購入）、Rag2-/-マウスおよびIl2rg-/-Rag2-/-マウス（当研究室にて維持）は所属する理化学研究所生命医科学研究センター動物飼育室においてSPF環境下で維持、飼育したものを用いた。実験の遂行に当たっては、理化学研究所横浜キャンパス動物実験委員会の承認を得るとともに、ガイドラインに従って実験を行った。

2) 脂肪組織からのILC2の分離
野生型マウスから腸間膜脂肪組織、精巣上体脂肪組織、皮下脂肪組織、肩甲骨付近の褐色脂肪組織を摘出した。脂肪組織はハサミで刻み10ug/ml Liberase DHによる酵素処理を行った後、遠心し細胞を単離した、さらにACK Lysis Bufferを加えて赤血球の溶血処理を行い細胞溶液とした。

3) 抗体染色とフローサイトメトリーによる解析
(2)で精製した細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。ILC2を検出するために、抗Lineageマーカー(CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD11c、CD19、TER119, B220、NK1.1、Gr-1, FcεRIα、F4/80)のbiotin化抗体によりFc受容体のブロック抗体と共に一次染色した後、蛍光色素により標識したStreptavidinおよび抗KLRG1、抗NKp46、抗GATA3、抗RORγt抗体で染色した。フローサイトメトリーによる解析は、FACS CantoII、FACS AriaIIu、FACS AriaIII(BD)を使用し、画像解析はFlowJoを用いて行った。

4) RNA抽出およびcDNA合成、定量PCR
摘出した脂肪組織からIsogen(Nippon Gene)およびTrizol(Thermo Fisher Scientific)を用いてRNA抽出した。次に、SuperScriptⅢ逆転写酵素(Life Technologies)を用いて、RNAからcDNAを合成した。合成したcDNAをStepOne PlusTM(Life Technologies)を用いて定量PCR解析を行った。定量PCRはSsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を用いたインターカレーター法により解析を行った。

5) C3H10T1/2細胞の培養およびOil red O染色
C3H10T1/2細胞(ATCC)は、EMEM(ATCC), 10%FBS(Gibco), 100U/ml penicillin(Life Technologies)を用い、37℃5%CO2条件下で培養した。脂肪細胞分化のために、1.0uM IBMX(Sigma), 0.5mM dexamethasone, および1.0ug/mlのインスリンを加え培養した。培養後の細胞はPBSを用いて洗浄し、10%ホルマリン液で30分間固定した。60%イソプロパノールを加え乾燥させた後、60%のOil red O(Sigma)で20分間反応させた。


6) 組織学的解析
肩甲骨付近の褐色脂肪組織を摘出し、10%ホルマリン液で固定した。固定した組織をパラフィン包埋し、2umの切片を作製した。切片はヘマトキシリンおよびエオジン溶液を用いてH&E染色した。


3. 研究結果
1) ILC2は脂肪組織に多く存在する
　定常状態でのILC2の脂肪組織での局在を調べるために、腸間膜脂肪組織(mesenteric white adiposetissue; mWAT)、精巣上体脂肪組織(epididymal adipose tissue; eWAT)、皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue; sWAT)から細胞を単離しフローサイトメトリーにより解析した(図2)。CD45+Lineage-NKp46-KLRG1+で示されるILC2は全ての脂肪組織に存在し、sWATに比べると内臓脂肪組織(visceral white adipose tissue; vWAT)に多いことが分かった。一方で、他の自然リンパ球ILC1やNK細胞、ILC3も脂肪組織に存在するが、mWATにはILC2が最も高い割合で存在していた。

2) ILC2は脂肪細胞の分化を誘導する
　次にILC2による脂肪細胞*への影響を調べるために、T, B, NKT細胞などの獲得免疫系のリンパ球を欠損するRag2-/-マウス、および獲得免疫系のリンパ球に加えILC2を含む全てのリンパ球を欠損するIl2rg-/-Rag2-/-マウスの脂肪組織における脂肪前駆細胞の違いを調べた。CD34+PDGFRα+の脂肪前駆細胞の数は、Rag2-/-マウスに比べてIl2rg-/-Rag2-/-マウスで多く、未成熟脂肪細胞で発現するPdgfraの発現もRag2-/-マウスに比べてIl2rg-/-Rag2-/-マウスで高かった(図3A)。さらに、定常状態でILC2を欠損するRoraflox/flox Vav1-iCreマウスでは、脂肪組織における脂肪前駆細胞マーカーCd34の発現が対照群に比べて高いことが分かった(図3B)。また、間葉系幹細胞株であり脂肪細胞への分化能を持つC3H10T1/2細胞とILC2を共培養し、ILC2による脂肪細胞分化の影響を調べたところ、共培養群において脂肪細胞分化が亢進した（図3C）。これらの結果からILC2は脂肪前駆細胞に作用することで脂肪細胞の分化に関与すると考えられた。

3) 腸間膜脂肪組織のILC2はBMP7を発現する
　次に、ILC2がどのように脂肪細胞分化を亢進するのかを明らかにするために、脂肪組織で作用し得る新規エフェクター分子の解析を行った。RNAシークエンス解析の結果、ILC2は他の免疫細胞と比較しTGFβファミリーに分類されるBone morphogenic protein 7(BMP7)*を高発現していることを見出した。RNAシークエンス解析の結果を確認するために、脂肪組織と腸管からILC2を単離し定量PCRを行ったところ、脂肪組織、腸管いずれのILC2においてもBMP7の発現が見られた(図4A)。次に、ChIPシークエンス解析によりサイトカイン刺激時のILC2を用いてヒストンメチル化を調べたところ、H3K4のトリメチル化が見られたことから、Bmp7遺伝子の転写が活性化状態であることが分かった(図4B)。BMP7は脂肪細胞の分化を誘導することがこれまでに報告されており(5)、ILC2がBMP7を産生することで脂肪細胞分化を亢進し、生体内の恒常性維持に関与する可能性が示唆された。

4) ILC2が産生するBMP7は褐色脂肪細胞の分化を制御する
　BMP7は脂肪前駆細胞からエネルギーを熱として放出する褐色脂肪細胞への分化に必須であることが知られている(5)。そこで、褐色脂肪細胞の分化におけるILC2が産生するBMP7の役割を明らかにするために、タモキシフェンを投与し全身でBMP7を欠損させたBmp7flox/flox Cre-ERT2マウス(図5A)から単離したILC2と野生型マウスの褐色脂肪組織から単離した脂肪前駆細胞を含むstromal vascular fraction(SVF)を共培養した。培養後のSVFにおける脂肪細胞マーカーの発現を調べたところ、対照群に比べて、BMP7欠損ILC2との共培養では脂肪前駆細胞で発現の高いCd34およびMmp2の発現が高いことが明らかとなった(図5B)。さらに、血球系細胞でBMP7を欠損したマウスであるBmp7flox/flox Vav1-iCreマウスの褐色脂肪組織の組織切片を作製し形態を調べたところ、対照群に比べて脂肪滴の大きさが大きいことが分かった(図5C)。この結果から、ILC2からのBMP7が脂肪滴の数を抑制し、褐色脂肪細胞の分化を亢進している可能性が示唆された。
　以上の結果から、ILC2が産生するBMP7は脂肪前駆細胞の脂肪細胞マーカーの発現を制御することで、脂肪前駆細胞からの褐色脂肪細胞の分化を誘導することが明らかとなった。

4. 討論
　本研究では、詳細が未だ明らかでなかったILC2の脂肪組織への寄与を精査した。ILC2は他の免疫細胞と比べてBmp7を高発現しており、定常状態でILC2はBMP7を産生することで褐色脂肪細胞の分化に働くことが明らかとなった。これまでに、ILC2は2型サイトカインを多量に産生することでアレルギー炎症や寄生虫排除に働くことが報告されてきたが、定常状態でのILC2の機能は不明な点が多かった。脂肪組織のILC2はIL-33により活性化され、2型の免疫応答を通して白色脂肪組織の褐色化を誘導することがすでに報告されている(6)(7)。本研究で着目しているBmp7は活性化状態のILC2では発現が抑制されることを明らかにしており、ILC2が産生するBMP7の褐色脂肪細胞分化への寄与は非活性化状態での機能と考えられる。今回の結果から、ILC2が産生するBMP7はILC2の脂肪組織における脂肪分化誘導の役割の一部を担っていると考えられるが、定常状態と炎症状態でのILC2の機能の違いやILC2と脂肪細胞との相互作用に焦点を当てた研究を続けることで、ILC2が脂肪組織に多く存在する意義を解明できると考えられる。

5. まとめ
1) ILC2は脂肪細胞の分化に関与する。
2) ILC2はTGFβファミリーに分類されるBMP7を発現する。
3) ILC2が産生するBMP7は褐色脂肪細胞分化を制御する。

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

1 Bartelt, A. and Heeren, J. 2014. Adipose tissue browning and metabolic health. Nat. Rev. Endocrinol. 10:24.

2 Wu, J., Boström, P., Sparks, L. M. et al. 2012. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150:366–76.

3 Petrovic, N., Walden, T. B., Shabalina, I. G., Timmons, J. A., Cannon, B. and Nedergaard, J. 2010. Chronic peroxi- some proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a popula- tion of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. J. Biol. Chem. 285:7153.

4 Ishibashi, J. and Seale, P. 2010. Medicine. Beige can be slim- ming. Science 328:1113.

5 Dudley, A. T., Lyons, K. M. and Robertson, E. J. 1995. A require- ment for bone morphogenetic protein-7 during development of the mammalian kidney and eye. Genes Dev. 9:2795.

6 Luo, G., Hofmann, C., Bronckers, A. L., Sohocki, M., Bradley, A. and Karsenty, G. 1995. BMP-7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning. Genes Dev. 9:2808.

7 Tseng, Y. H., Kokkotou, E., Schulz, T. J. et al. 2008. New role of bone morphogenetic protein 7 in brown adipogenesis and en- ergy expenditure. Nature 454:1000.

8 Chen, T. L., Shen, W. J. and Kraemer, F. B. 2001. Human BMP-7/ OP-1 induces the growth and differentiation of adipocytes and osteoblasts in bone marrow stromal cell cultures. J. Cell. Biochem. 82:187.

9 Yasmin, N., Bauer, T., Modak, M. et al. 2013. Identification of bone morphogenetic protein 7 (BMP7) as an instructive factor for human epidermal Langerhans cell differentiation. J. Exp. Med. 210:2597.

10 Moro, K., Yamada, T., Tanabe, M. et al. 2010. Innate production of T(H)2 cytokines by adipose tissue-associated c-Kit(+)Sca-1(+) lymphoid cells. Nature 463:540.

11 Monticelli, L. A., Osborne, L. C., Noti, M., Tran, S. V., Zaiss, D. M. and Artis, D. 2015. IL-33 promotes an innate immune pathway of intestinal tissue protection dependent on amphiregulin-EGFR interactions. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112:10762.

12 von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E. and Locksley, R. M. 2016. Tuft- cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature 529:221.

13 Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y. and Rudensky, A. Y. 2015. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science 350:981.

14 Festa, E., Fretz, J., Berry, R. et al. 2011. Adipocyte lineage cells contribute to the skin stem cell niche to drive hair cycling. Cell 146:761.

15 Rivera-Gonzalez, G., Shook, B. and Horsley, V. 2014. Adipocytes in skin health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4:a015271.

16 Rodeheffer, M. S., Birsoy, K. and Friedman, J. M. 2008. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell 135:240.

17 Berry, R. and Rodeheffer, M. S. 2013. Characterization of the adi- pocyte cellular lineage in vivo. Nat. Cell Biol. 15:302.

18 Bouloumié, A., Sengenès, C., Portolan, G., Galitzky, J. and Lafontan, M. 2001. Adipocyte produces matrix metalloproteinases 2 and 9: involvement in adipose differentiation. Diabetes 50:2080.

19 Chavey, C., Mari, B., Monthouel, M. N. et al. 2003. Matrix metalloproteinases are differentially expressed in adipose tissue during obesity and modulate adipocyte differentiation. J. Biol. Chem. 278:11888.

20 Croissandeau, G., Chrétien, M. and Mbikay, M. 2002. Involvement of matrix metalloproteinases in the adipose conversion of 3T3-L1 preadipocytes. Biochem. J. 364:739.

21 Cawthorn, W. P., Scheller, E. L. and MacDougald, O. A. 2012. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. J. Lipid Res. 53:227.

22 Zouvelou, V., Passa, O., Segklia, K. et al. 2009. Generation and functional characterization of mice with a conditional BMP7 allele. Int. J. Dev. Biol. 53:597.

23 Moro, K., Ealey, K. N., Kabata, H. and Koyasu, S. 2015. Isolation and analysis of group 2 innate lymphoid cells in mice. Nat. Protoc. 10:792.

24 Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. et al. 2012. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9:676.

25 Xu, J. 2005. Preparation, culture, and immortalization of mouse embryonic fibroblasts. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 28:Unit 28.1.

26 Brestoff, J. R., Kim, B. S., Saenz, S. A. et al. 2015. Group 2 innate lymphoid cells promote beiging of white adipose tissue and limit obesity. Nature 519:242.

27 Lee, M. W., Odegaard, J. I., Mukundan, L. et al. 2015. Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis. Cell 160:74.

28 Miller, A. M., Asquith, D. L., Hueber, A. J. et al. 2010. Interleukin-33 induces protective effects in adipose tissue inflammation during obesity in mice. Circ. Res. 107:650.

29 Qiu, Y., Nguyen, K. D., Odegaard, J. I. et al. 2014. Eosinophils and type 2 cytokine signaling in macrophages orchestrate devel- opment of functional beige fat. Cell 157:1292.

30 Sasaki, T., Moro, K., Kubota, T. et al. 2019. Innate lymphoid cells in the induction of obesity. Cell Rep. 28:202.

31 Green, H. and Meuth, M. 1974. An established pre-adipose cell line and its differentiation in culture. Cell 7:127.

32 Green, H. and Kehinde, O. 1976. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell 7:105.

33 Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M. and Brandsch, M. 2012. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal. Biochem. 425:88.

34 Schulz, T. J. and Tseng, Y. H. 2013. Brown adipose tissue: devel- opment, metabolism and beyond. Biochem. J. 453:167.

35 Huang, H., Song, T. J., Li, X. et al. 2009. BMP signaling pathway is required for commitment of C3H10T1/2 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106:12670.

36 Schulz, T. J., Huang, T. L., Tran, T. T. et al. 2011. Identification of inducible brown adipocyte progenitors residing in skeletal muscle and white fat. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108:143.

37 Robinette, M. L., Fuchs, A., Cortez, V. S. et al.; Immunological Genome Consortium. 2015. Transcriptional programs define molecular characteristics of innate lymphoid cell classes and subsets. Nat. Immunol. 16:306.

38 Massagué, J. 2000. How cells read TGF-beta signals. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169.

39 Yamashita, H., ten Dijke, P., Huylebroeck, D. et al. 1995. Osteogenic protein-1 binds to activin type II receptors and in- duces certain activin-like effects. J. Cell Biol. 130:217.

40 Rosenzweig, B. L., Imamurat4, T., Okadome, T. et al. 1995. Cloning and characterization of a human type II receptor for bone morphogenetic proteins [osteogenic protein/transforming growth factor .8 superfamily/serine(threonine) kinase receptor/cDNA cloning]. Biochem. Cloning 92:7632.

41 Kawabata, M., Chytil, A. and Moses, H. L. 1995. Cloning of a novel type II serine/threonine kinase receptor through interaction with the type I transforming growth factor-beta receptor. J. Biol. Chem. 270:5625.

42 Kishigami, S. and Mishina, Y. 2005. BMP signaling and early em- bryonic patterning. Cytokine Growth Factor Rev. 16:265.

43 Reznikoff, C. A., Brankow, D. W. and Heidelberger, C. 1973. Establishment and characterization of a cloned line of C3H mouse embryo cells sensitive to postconfluence inhibition of div- ision. Cancer Res. 33:3231.

44 Ahrens, M., Ankenbauer, T., Schröder, D., Hollnagel, A., Mayer, H. and Gross, G. 1993. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lin- eages. DNA Cell Biol. 12:871.

45 Wang, E. A., Israel, D. I., Kelly, S. and Luxenberg, D. P. 1993. Bone morphogenetic protein-2 causes commitment and differen- tiation in C3H10T1/2 and 3T3 cells. Growth Factors 9:57.

46 Armani, A., Mammi, C., Marzolla, V. et al. 2010. Cellular models for understanding adipogenesis, adipose dysfunction, and obesity. J. Cell. Biochem. 110:564.

47 Tomita, M., Asada, M., Asada, N. et al. 2013. Bmp7 maintains undifferentiated kidney progenitor population and determines nephron numbers at birth. PLoS One 8:e73554.

48 Cohen, P., Levy, J. D., Zhang, Y. et al. 2014. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcuta- neous to visceral fat switch. Cell 156:304.

49 Hondares, E., Rosell, M., Díaz-Delfín, J. et al. 2011. Peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) induces PPARγ coactivator 1α (PGC-1α) gene expression and contributes to thermogenic activation of brown fat: involvement of PRDM16. J. Biol. Chem. 286:43112.

50 Koga, S., Hozumi, K., Hirano, K. I. et al. 2018. Peripheral PDG FRa+gp38+ mesenchymal cells support the differentiation of fetal liver-derived ILC2. J. Exp. Med. 215:1609.

参考文献をもっと見る

全国の大学の
卒論・修論・学位論文
を
一発検索！

この論文の関連論文を見る