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Crystal structures of CRISPR-Cas9 and RNA methyltransferase

平野, 清一 東京大学 DOI:10.15083/0002004767

2022.06.22

概要

⽣命が設計図であるゲノムから実際に成り⽴つ過程において、DNAおよびRNAはタンパク質と相互作⽤し変化する。本研究ではX線結晶構造解析によって、RNA依存性DNA切断酵素Cas9およびRNAメチル化酵素CAPAMが標的の核酸を認識し作⽤する分⼦メカニズムを明らかにした。

Cas9は原核⽣物の獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼである。Cas9とガイドRNAを細胞に導⼊することで、ゲノムの特定の領域を切断しDNA配列を改変することができるため、現在ゲノム編集ツールとして広く利⽤されている。Cas9-ガイドRNA複合体は、PAM（protospacer adjacent motif）とよばれる特定の2‒5塩基を認識した後、20塩基程度のガイド配列と相補的な標的配列をほどき、⼆本鎖DNA切断を引き起こす。

ゲノム編集に広く利⽤されているSpCas9はNGGという配列をPAMとして認識するため、ゲノム編集可能なゲノム領域には制限が存在するという問題が残されている。ゲノム編集の標的部位を拡張するために、分⼦進化的⼿法によって、異なるPAMを認識するSpCas9改変体（VQR改変体およびVRER改変体）が開発された。VQR改変体は3重変異（D1135V/R1335Q/T1337R）をもちNGAをPAMとして認識する⼀⽅、VRER改変体は4重変異（D1135V/G1218R/R1335E/T1337R）をもちNGCGをPAMとして認識する。しかし、複数の変異が導⼊されたSpCas9改変体が異なるPAMを認識する分⼦機構は不明であった。そこで本研究では、VQR改変体-ガイドRNA-標的DNA（TGAPAM）、および、VRER改変体-ガイドRNA-標的DNA（TGCGPAM）複合体の結晶構造を決定した。野⽣型SpCas9の結晶構造ではPAMの2、3⽂字⽬のGがArg1333、Arg1335と⽔素結合を形成する⼀⽅で、VQR改変体ではPAMの2、3⽂字⽬のG、AがArg1333、Gln1335（R1335Q）と⽔素結合を形成しており、VRER改変体ではPAMの2、3、4⽂字⽬のG、C、GがArg1333、Glu1335（R1335E）、Arg1337（T1337R）と⽔素結合を形成していた（図2）。野⽣型SpCas9とSpCas9改変体の構造の⽐較から、DNAの糖-リン酸⾻格が予想外の構造変化を起こし、PAMの3⽂字⽬の塩基が1335番⽬の残基に近づいていることが明らかになった。Val1135（D1135V）、Arg1218（G1218R）はDNAの糖-リン酸⾻格と相互作⽤し、このDNAの構造変化を促進していた。

SpCas9はNGGという配列をPAMとして認識するのに対し、CdCas9はNNRHHHY（RはA/G、HはA/T/C、YはT/C）という配列をPAMとして認識する。CdCas9は5⽂字の塩基が組み合わさった108通り（2×3×3×3×2）のPAMを認識できるため、標的範囲の広いゲノム編集ツールとして期待されている。しかし、CdCas9による複雑なPAM認識機構は不明であった。そこで本研究では、CdCas9-ガイドRNA-標的DNA（TGGTAATPAM）複合体の結晶構造を決定した。CdCas9は、SpCas9と類似構造をもつドメインを⽤いてガイドRNAや標的DNAを認識する⼀⽅で、SpCas9とは異なるアミノ酸残基を⽤いてPAM配列を認識していることが明らかになった。PAMの3⽂字⽬のGはArg1017と⽔素結合を形成し、PAMの7⽂字⽬のTと相補するAはLys1015と⽔素結合を形成していた。PAMの5、6⽂字⽬のAと相補するTは、Phe1011、Pro1043、Leu1046によって形成される疎⽔性パッチと相互作⽤していた。これらのことから、他のCas9とは異なり、CdCas9は疎⽔性相互作⽤と⽔素結合を組み合わせて利⽤することにより、複雑な108通りのPAMを認識することが明らかになった。

真核⽣物のmRNAが転写後修飾をうけることは古くから知られていたが、その全容は謎に包まれていた。最近のエピトランスクリプトーム解析技術の進歩により、mRNAの転写後修飾が数多く同定され、発⽣の各段階やストレス応答時など特定の状況下において、転写後修飾をもつmRNAが⼀⻫に制御を受けるという新しい遺伝⼦発現制御の概念が提唱されている。mRNAの転写後修飾のなかで、アデニン6位のアミノ基がメチル化されたm6A修飾は最も注⽬されており、遺伝⼦の発現制御を通して、がんや神経変性などの疾患、および、性決定などの⽣命現象に関わっていることが明らかになってきた。真核⽣物のmRNAは5′端にm7G塩基が三リン酸や反転したリボースで結合した特徴的な構造をもつ（5′キャップ）。Cap-specific adenosine-N6-methyltransferase（CAPAM）は5′キャップに隣接するAをm6A修飾し、CAPAMのノックアウト細胞ではストレス応答遺伝⼦などの翻訳が抑制され、ストレス条件下での成育が阻害されることが明らかにされていた。しかし、CAPAMがどのようにmRNAの5′キャップを認識し、隣接するAをメチル化するかは不明であった。そこで本研究では、ゼブラフィッシュ由来CAPAM、5′キャップ、メチル基供与体アナログ（SAH）からなる複合体の結晶構造を決定した。

結晶構造から、CAPAMはメチル化転移酵素に共通するロスマンフォールドをもつメチル化ドメイン、および、αヘリックスが⼊り組んだ新規フォールドをもつヘリカルドメインから構成されることが明らかになった。5′キャップはメチル化ドメインとヘリカルドメインの間のポケットで認識され、メチル基供与体アナログ（SAH）はメチル化ドメインの触媒ポケットで認識されていた。変異体解析から、標的アデニン塩基は他のm6A修飾酵素と同様にメチル化ドメインの活性部位で認識され、RNAの下流部分はヘリカルドメインの正に帯電した溝に結合することが⽰唆された。さらに、CAPAMと他のm6A修飾酵素の構造⽐較から、これらのm6A修飾酵素は保存されたメチル化ドメインを⽤いてアデニンをメチル化する⼀⽅で、多様なフォールドをもつ付加ドメインを⽤いてRNAに対する特異性を獲得していることが明らかになった。

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