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Structural and functional analyses of tetraspanin protein CD9 by X-ray crystallography and Cryo-electron microscopy

梅田, 理愛 東京大学 DOI:10.15083/0002001910

2021.10.04

概要

テトラスパニンは真核生物に広く保存された4回膜貫通型のタンパク質ファミリーで、ヒトでは33種類が保存されている。ファミリーに共通する構造として、4本の膜貫通ヘリックス（TM1-4）と長さの異なる2つの細胞外ループ、すなわちTM1とTM2の間のshort extracellular loop(SEL)およびTM3とTM4の間のlarge extracellular loop(LEL)を持つ。過去の多くの研究から、テトラスパニンファミリータンパクが接着因子や細胞増殖因子受容体、細胞内足場タンパクなどの機能性タンパク質と相互作用し、Tetraspanin enriched microdomain(TEM)と呼ばれるドメインを形成すると考えられてきた。テトラスパニンと相互作用するパートナータンパク質は多岐にわたり、そのためテトラスパニンは細胞遊走や増殖、細胞融合といった多様な細胞機能に関わっていると考えられ、そのシグナルプラットフォームとしての役割が注目を集めている。また、その細胞機能を通じて、がんの遊走・浸潤や増殖、C型肝炎ウイルス感染において重要な役割を担うことが報告されており、抗がん剤やウイルス感染の阻害剤としても注目を集めている。

　しかしながら、その機能の重要性にも関わらず、テトラスパニンがどのようにシグナル経路を調節しているのか、その分子機構は未だ不明である。過去にはテトラスパニンファミリーであるCD81の結晶構造が報告され、その基本的な構造が明らかになっているが、例えばTEMへの分子の集積機構、すなわちテトラスパニンがどのように相互作用し、パートナータンパク質を集積してくるのかはわかっていない。テトラスパニンの細胞における機能の詳細を明らかにするために、さらなる構造情報や機能解析が待たれている。

　これらの背景を受けて本研究では、テトラスパニンファミリーであるヒト由来タンパク質CD9のX線結晶構造解析を行った。CD9は最も機能が知られているテトラスパニンの一つで、様々な組織や細胞に広く発現している。特に受精において必須の役割を持つことが知られており、CD9をノックアウトした雌のマウスは、この雌から得られた卵子が精子と融合できないために不妊の表現型を示す。

　構造解析のため、筆者らは最初にヒト由来CD9の野生型の結晶化を試みた。しかしながら得られた結晶は非常に小さく、回折実験においても10Å程度の反射しか得られなかった。

　そこで、CD9分子内における特定の領域の柔軟性が密な結晶パッキングを阻害している可能性を鑑み、LELとC末端の一部の領域を欠失させた変異体を精製・結晶化したところ、LEL領域の5アミノ酸およびC末端領域の3アミノ酸を欠失した変異体でより良質な結晶を得ることに成功した。さらに実験的な位相決定のため、TM1にシステイン変異を導入し、塩化メチル水銀との共結晶化を行い、最終的に2.7Å分解能でCD9の構造決定に成功した。

　ヒトCD9は4本の膜貫通ヘリックスを持ち、細胞内側が密に束ねられる一方で細胞外側に広く開いて、膜貫通領域の内側に大きな空隙を作っていた。興味深いことに、この分子の非対称なコーン型がLCPの膜に曲率を作り出し、結晶内の分子の配列を波打たせていた。このCD9の非対称な膜の形状は、テトラスパニン分子のクラスタ化が膜の局所的な曲率を誘発し、細胞膜の再構成に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。筆者はまた、CD9の受精に必須な箇所を明らかにするため、in vitro fertilization essayを用いて構造を基にした変異体解析を行った。

　さらに筆者はヒトCD9とそのパートナータンパク質であるヒトEWI-2との複合体構造解析を、低温電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって行い、7.95Å分解能でこの構造を決定した。複合体はEWI-2とCD9のヘテロ二量体がさらに二量体化した構造で、2つのEWI-2分子が中央で密に二量体を形成し、それぞれのEWI-2分子の脇にCD9分子が1つずつ位置していた。またこの構造は両者の相互作用が膜貫通領域で調節されることを明らかにした。さらにこの相互作用を確かめるために、筆者は複合体形成アッセイを行い、CD9とEWI-2が中央の空隙の外側でTM3とTM4を介して相互作用することを明らかにした。

　本研究で明らかになった構造は、CD9の生理学的な役割、およびテトラスパニンとそれらのパートナータンパク質との相互作用機構をより理解するための知見を提供する。また先行研究からCD9のLELがパートナータンパク質の相互作用部位であると考えられてきたが、今回の構造から膜貫通領域とも相互作用しうるという新しい知見が得られた。これらの知見は構造的知見が乏しいテトラスパニンおよびそのパートナータンパク質の理解を大きく進めるとともに、多岐にわたる細胞機能に関わるテトラスパニンの相互作用部位の多様性について、有益な示唆を与えるものである。

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