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自然免疫受容体TLR7の構造生物学的研究

張, 志寛 東京大学 DOI:10.15083/0002008286

2023.12.27

概要




















張 志寛

Toll 様受容体 (Toll-like receptor: TLR) は、自然免疫システムにおいて中心的な役割を果た
している。TLR は病原体の分子パターンの認識を行う細胞外ロイシンリッチリピート (LRR) ド
メイン、一回膜貫通ヘリクッスおよびシグナル伝達を行う細胞内 TIR ドメインから構成されて
いる。一般的に TLR はリガンド非結合状態では単量体であり、アゴニストが結合することによ
って活性化型の 2 量体となり、免疫活性化シグナルが伝達されることが知られている。
TLR7 は RNA ウイルス由来の一本鎖 RNA (ssRNA) を認識し、RNA ウイルスによる感染症
と関与している。また、TLR7 はグアノシン (G)および R848 などの低分子アゴニストにも活性
化されると知られている。これまでには、TLR7 の立体構造およびアゴニストによる活性化機構
は未知であった。一方、TLR7 の過剰な活性化は自己免疫疾患の発症と関連していると知られて
いる。そのため、TLR7 のアンタゴニストも開発されているが、これらのアンタゴニストの作用
機序および TLR7 の阻害機構の分子基盤に関しては不明であった。
本論文は、TLR7 について、アゴニストによる活性化機構およびアンタゴニストによる阻害機
構の解明を目的とした構造生物学的な研究成果を述べたものである。
まずアゴニストによる TLR7 の活性化機構の解明について記す。構造解析に適した高純度の
TLR7 タンパク質を調製するため、サル TLR7 細胞外ドメインをショウジョウバエ S2 細胞で発
現させた。正常な機能を持つ TLR7 タンパク質を得るため、自己阻害に関わる Z-loop 領域をト
ロンビンで切断した。ゲル濾過クロマトグラフィーと超遠心分析などの様々な生化学解析により
以下のことを見出している。①TLR7 は ssRNA と低分子アゴニストを協同的に認識すること②
リガンド非結合型の TLR7 は単量体であること③Polyuridine (polyU) は TLR7 と強く結合する
が、TLR7 の 2 量体形成を引き
起こさない。④G は TLR7 の 2
量体化をわずかに誘導するが、
R848 は強く TLR7 の 2 量体化
を誘導する。⑤ITC 分析におい
て、G または R848 などの低分
子アゴニストと TLR7 の結合
は polyU 存在下では polyU 非

図 1: TLR7/G/polyU 三者複合体の結晶構造

存在化に比べて約 5~10 倍強くなる。以上の結果から、強い親和性を持つ ssRNA が TLR7 の低
分子アゴニストの結合を促進するシナジー効果を見出した。
天然アゴニストによる TLR7 の活性化機構を可視化するため、TLR7/G/polyU 三者複合体の
結晶構造を決定した (図 1)。TLR7/G/polyU は 2:2:2 複合体を形成しており、G は TLR7 の 2 量
体界面における site 1 に結合しており、TLR7 の 2 量体化を直接に誘導する。PolyU の断片の
UUU が TLR7 の N 末端側の凹面および Z-loop から構成されている site 2 に結合している。Site
2 は 2 量体界面の近傍に位置しており、polyU の結合はアロステリックに TLR7 の 2 量体を安
定化する。結晶構造から、site 1 はヌクレオシドの中に G
を特異的に認識し、site 2 においては非末端ウリジン塩基
(U) は ssRNA の結合に必須であることが明らかになった。
さらに、site 2 における ssRNA 認識の配列特異性を同
定するため、TLR7 と 13 種類の ssRNA との共結晶構造を
解明した。その結果、連続したウリジン塩基を有する
ssRNA が優先的に site 2 に結合することがわかった。
TLR7/天然アゴニスト複合体の構造解析に加え、6 種類の
TLR7/合成低分子アゴニスト複合体の結晶構造も決定し
た (図 2)。合成低分子アゴニストは TLR7 の site 1 に結合
しており、G のように TLR7 の 2 量体化を誘導する。合成

図 2: 6 種類の TLR7/合成低分子
アゴニスト複合体 の結晶構造の重

低分子アゴニストは G と比べて、より多様な相互作用様

ね合わせ

式を示し、主に 4 種類の特徴的な相互作用を利用して TLR7 の site 1 に結合する。
次に、アンタゴニストによる TLR7 の阻害機構の解明について記す。本論文では、アンタゴ
ニストとして、大日本住友製薬株式会社の東城慎吾博士から供与された Cpd-6 および Cpd-7 を

図 3: TLR7/Cpd-3、TLR7/Cpd-6 および TLR7/Cpd-7 複合体の cryo-EM
密度マップ

用いた。これらのアンタゴニストは同社が開発した Cpd-3 (アゴニスト) をリード化合物として
開発された。そのうちの Cpd-7 は自然免疫モデルマウスに対して、良好な治療効果を示してい
た。クロスリンクアッセイおよび ITC 分析の結果から、Cpd-6 と Cpd-7 は TLR7 と直接に結合
し、TLR7 の 2 量体化を誘導したことが明らかになった。TLR7/Cpd-6 複合体の結晶構造解析に
成功したが奇妙なことに活性化型 2 量体構造を形成しており、この結晶構造からアンタゴニス
トによる TLR7 の阻害機構の考察は困難であった。
そこで、クライオ電子顕微鏡 (Cryo-EM) 解析を用い、アンタゴニストによる TLR7 の構造変
化を観察することにした。TLR7/Cpd-3、TLR7/Cpd-6 および TLR7/Cpd-7 複合体の cryo-EM
構造解析を行った (図 3)。TLR7/Cpd-3 複合体は結晶構造で示した活性化型 2 量体が観察され
た。TLR7/Cpd-6 では活性化型 2 量体および不活性化型 2 量体の 2 種類の異なるコンフォメー
ションが観察された。Cpd7 では主に不活性化型 2 量体が観察された。したがって、Cpd-6 およ
び Cpd-7 は TLR7 の不活性化型 2 量体を誘導することで、TLR7 が安定な活性化状態を保持で
きず、阻害状態となると結論付けた。
さらに、アンタゴニストの詳細な認識機構を可
視化するため、TLR7/Cpd-7 複合体の cryo-EM
構造を 2.8-Å 分解能で決定した (図 4)。Cpd-7 は
TLR7 の不活性化型 2 量体で新たに見られたアン
タゴニスト結合部位に結合していた。この結合部
位は活性化型 2 量体の site 1 と空間的に近く、両
方で共通する残基もあるが、両者におけるリガン
ド認識機構は全く共通していない 。Cpd-7 は
TLR7 と特徴的な疎水性相互作用および水素結
合を形成し、TLR7 の不活性化型 2 量体を安定化
する。
本研究で、一連の TLR7/アゴニスト複合体の結

図 4: TLR7/Cpd-7 複合体のクライオ
電顕構造

晶構造を解明し、低分子アゴニストおよび ssRNA の 2 種類のリガンドによる TLR7 の活性化機
構を分子レベルで明らかにした。さらに、Cryo-EM 解析により、TLR7 の低分子アンタゴニス
トによる阻害機構の分子基盤も解明した。これらの構造的知見は TLR7 を標的とした免疫賦活
剤または免疫抑制剤の開発と構造基盤となる。本論文はこれまで不明だったリガンドによる
TLR7 の活性化機構および阻害機構を解明したものであり、博士 (薬科学)の学位請求論文とし
て合格と認められる。

この論文で使われている画像

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227

7. 謝辞

本研究を行う上で有益な御指導、御討論、御助力を賜りました東京大学大学院薬学系研究科

蛋⽩構造生物学教室 清水 敏之 教授に心から御礼申し上げます。

本研究を進めるに当たり、一から実験の御指導、御助言を賜りました東京大学大学院薬学系

研究科蛋⽩構造生物学教室 大⼾ 梅治 准教授に心から御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、レポータージーンアッセイを用いた活性測定を行ってくださ

った東京大学医科学研究所感染・免疫部門感染遺伝学分野 三宅 健介 教授、柴田 琢磨 博

士および佐藤 亮太 博士に心から御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、LC-MS を用いた結晶溶液の分析を行ってくださった首都大学

東京大学院理工学研究科分子物質科学専攻 礒邉 俊明 特任教授、田岡 万悟 博士、山内 芳

雄 博士に心から御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、SV-AUC を用いた TLR7 の分析を行ってくださった大阪大学

大学院工学研究科生命先端工学専攻 内山 進 教授および Elena Krayukhina 博士に心から

御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、IMDQ を提供してくださったミネソタ大学 Sunil A. David 教

授および Nikunj M. Shukla 博士に心から御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、リガンド (Cpd-1~Cpd-7) を提供してくださった大日本住友製

228

薬株式会社 東城慎吾 博士に心から御礼申し上げます。

本研究の共同研究者として、Glacios 電子顕微鏡測定を協力してくださった国立研究開発法

人理化学研究所 放射光科学研究センター 山本 雅貴 部門長および重松 秀樹 博士に心か

ら御礼申し上げます。

本研究の電子顕微鏡測定を協力してくださった東京大学医学系研究科・生体構造学分野 吉

川 雅英 教授、包 明久 博士および坂巻 陽一 技術補佐員に心から御礼申し上げます。

本研究の電子顕微鏡測定を協力してくださった高エネルギー加速器研究機構・Cryo-EM

facility 千田 俊哉 教授、安達 成彦 博士、川崎 政人 博士に心から御礼申し上げます。

本研究の先行研究者として、ベクターの作成などを行ってくださった元東京大学大学院薬

学系研究科蛋⽩構造生物学教室 丹治 裕美 博士に心から御礼申し上げます。

本研究における X 線回折実験において、有益な御助力を賜りました大型放射光施設 Photon

Factory 山田 悠介 博士、篠田 晃 博士およびビームラインスタッフの皆様に心から御礼申

し上げます。

本研究における X 線回折実験において、有益な御助力を賜りました大型放射光施設 SPring8 平田 邦夫 博士およびビームラインスタッフの皆様に心から御礼申し上げます。

東京大学大学院薬学系研究科蛋⽩構造生物学教室の皆様には日頃から大変御世話になりま

した。感謝いたします。

229

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